Cryopreservation of complex three-dimensional cell systems

Abstract

Human three-dimensional (3D) cell models provide the unique possibility to imitate the cellular architecture and physiology of human organs. They have become crucial in biomedical research in studying human developmental processes, diseases and therapeutic compounds. With their increasing importance, the demand for ready-to-use 3D cell models has risen. However, the lack of adequate long-term preservation strategies restricts their comprehensive use. Hence, this thesis focuses on the cryopreservation of 3D cell models to expand the knowledge about cryo-induced effects in multicellular systems. This work investigated the impact of different cryopreservation parameters on the cellular network and physiology of stem cell-derived spheroids and organoids with different properties. These 3D cell models showed significant structural changes after standard freezing. However, with gentle handling, cell viability, proliferation, genetic status and differentiation potential were maintained after thawing. These results could be further improved by dynamic recovery approaches or ice-free cryopreservation. Furthermore, a spectroscopic analysis method using Raman micro-spectroscopy to quantify the diffusion kinetics of various molecules was introduced and established. This technique enables the prediction of model-specific perfusion times of different compounds, such as cryoprotectants, in order to characterise and standardise cryopreservation procedures for 3D cell models.

Humane dreidimensionale (3D) Zellmodelle bieten die einzigartige Möglichkeit, die zelluläre Architektur und Physiologie menschlicher Organe nachzubilden. In der biomedizinischen Forschung sind sie von immer größerer Bedeutung, um humane Entwicklungsprozesse, Krankheiten und therapeutische Wirkstoffe zu untersuchen. Aus diesem Grund steigt die Nachfrage nach 3D-Zellmodellen, wobei ihre umfassende Nutzung durch das Fehlen geeigneter Langzeitkonservierungsstrategien eingeschränkt ist. Diese Arbeit befasst sich daher mit der Kryokonservierung von 3D Zellmodellen, um das Wissen über Kryo-Effekte in multizellulären Systemen zu erweitern. Dazu wurden die Auswirkungen verschiedener Kryoparameter auf Stammzell-basierte Sphäroide und Organoide mit unterschiedlichen Eigenschaften untersucht. Mittels Standard- Kryoverfahren wurden hierbei signifikante strukturelle Veränderungen nachgewiesen. Bei schonender Kultivierung nach dem Auftauen blieben jedoch Vitalität, Proliferation, Genexpression und Differenzierungspotential der Zellen erhalten. Dynamische Zellkultur oder eisfreie Kryokonservierung konnten dies weiter verbessern. Darüber hinaus wurde eine spektroskopische Analysemethode mittels Raman-Mikrospektroskopie zur Quantifizierung von Diffusionskinetiken diverser Moleküle eingeführt und etabliert. Diese Technik ermöglicht die Vorhersage modellspezifischer Perfusionszeiten verschiedener Substanzen, wie u.a. Kryoprotektiva, um Kryoverfahren für 3D-Zellmodelle zu standardisieren.