Impact of Tobacco smoking on sperm nuclear proteins genes : H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1, and PRM2 and its influence on male infertility

Abstract

During fertilization, the spermatozoon task is not limited to just deliver the male genome to the oocyte, it is beyond that. During the last stages of spermatogenesis, the spermatozoa develop to have a highly organized genome. The sperm DNA is compacted by nearly 85% of protamines and 15 % of histones carrying epigenetic signals, together with different kind of RNA molecules and proteins participate in post-fertilization events and mainly in embryo development. About 50% of infertility cases are referred to as idiopathic infertility, around 15% of it is due to genetic factors and 35% due to environmental factors. Tobacco smoke is one of the lifestyle factors that present a big threat for human health and it is believed to have an influence on male fertility and sperm quality by inducing epigenetic and/or genetic modulations on sperm genome. Thus, this study comes to fulfil a part in the remained gap in the comprehensive understanding of the expression and regulation of the genes in the human spermatozoa. The purposes of this study were first, to find out the effect of Tobacco smoke on sperm quality determined by standard parameters (WHO, 2010), sperm DNA maturity tested by Chromomycin A3 (CMA3) staining, sperm DNA fragmentation tested by TUNEL assay, and clinic outcomes after ICSI therapy. Second, to quantify the transcript levels of five nuclear proteins genes: H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1, and PRM2 by RT-PCR, correlate them with the previous parameters and determine the smoking effect on this gene expression and regulation. Finally, to determine the single nucleotides polymorphisms in three genes: H2BFWT, PRM1, and PRM2 by Sanger sequencing and their association to smoking and previous parameters. The study population (n=167) were male partners, randomly collected, of couples undergoing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) therapy, in reproductive age (25-49 years). The patients were divided into two groups: heavy-smokers group and non-smokers group. In heavy-smokers group a significant decrease (p<0.01) in standard semen parameters in comparison to non-smokers has been shown: sperm concentration (62.17 ± 51.68 mill/ml vs. 88.09 ± 63.42 mill/ml), progressive motility (PR) (14.86 ± 10.95% vs. 27.31 ± 21.78%), and sperm normal morphology (4.01 ± 2.88% vs. 10.87 ± 12.11%). Besides, the mean percentage of protamine deficiency (CMA3 positivity) and sperm DNA fragmentation (sDF) were significantly higher (p<0.01) in heavy-smokers than in nonsmokers (33.30 ± 23.33% vs. 20.35 ± 13.43% and 26.86 ± 19.77% vs.14.23 ± 13.07% respectively). A significant positive correlation has been found between CMA3 positivity and sDF (r=0.484, p=0.0001) in the group of heavy-smokers, and no correlation (r=0.256, p=0.098) between these two parameters in the non-smokers group. In the present study, by comparing the ICSI results between the heavy-smokers and nonsmokers, the pregnancy rate was significantly higher in the group of non-smokers than the heavy-smokers group (0.60 ± 0.49% vs. 0.38 ± 0.48%, p=0.013), other parameters showed no significant differences. Furthermore, the transcript level of each studied gene mRNA (mean delta Ct) was differentially expressed between the heavy-smokers and non-smokers groups and this difference was highly significant (p<0.01). H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1 and PRM2 genes were down-regulated in spermatozoa of heavy-smoker compared to non-smoker (Fold change<0.5) and were significantly correlated between each other (p<0.01). Moreover, the protamine mRNA ratio, in the current study, was significantly higher in the heavy-smokers group in comparison to the non-smokers group (0.60 ± 1.08 vs. 0.11 ± 0.84, p=0.001). In the non-smokers group, protamine ratio correlated positively with the expression levels of TNP2 (r=0.349, p=0.032) and PRM2 (r=0.488, p=0.001). However, in the heavysmokers group, it correlated positively to TNP2 transcript (r=0.307, p=0.004), PRM2 transcript (r=0.445, p=0.0001), and H2BFWT transcript (r=0.342, p=0.001). Only in the group of heavy-smokers, the protamine ratio significantly correlates with CMA3 positivity (r=0.413, p=0.0001) and sDF (r=0.302, p=0.003). Moreover, the present study demonstrated the absence of a connection between genetic variations founded in H2BFWT gene (rs7885967, rs553509 and rs578953), protamines genes PRM1 (rs737008) and PRM2 (rs2070923 and rs1646022) and fertility alteration in heavy-smoker and non-smoker males. In conclusion, the results of this study demonstrated that smoking has inverse effects on sperm quality, sperm DNA integrity, mRNA expression levels of H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1and PRM2 genes and protamine mRNA ratio, but has no effect on the nucleotides sequences of these genes. This suggests that the RNA of the studied genes and protamine mRNA ratio in the sperm of male partners of ICSI patients are good predictive factors to evaluate the sperm quality and its fertilizing capacity.

Das Spermium hat während der Befruchtung mehrere Aufgaben. Zum einen muss das männliche Genom zur Eizelle. Des Weiteren entwickeln sich die Spermien in den letzten Stadien der Spermatogenese zu einem hoch organisierten Genom. Die Spermien-DNA wird aus Protaminen (ca. 85%) und Histonen (ca. 15%) gebildet, zusammen mit verschiedenen Arten von RNA-Molekülen und Proteinen. Diese sind vor allem an Prozessen nach der Fertilisation beteiligt und nehmen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung ein. Etwa 50% der Fälle von Unfruchtbarkeit werden als idiopathische Unfruchtbarkeit bezeichnet, davon sind 15% auf genetische Faktoren und 35% auf Umweltfaktoren zurückzuführen. Tabakrauch ist einer der Lebensstilfaktoren, die eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen. Es wird angenommen, dass Rauchen Einfluss auf die männliche Fruchtbarkeit und Spermienqualität hat, indem es epigenetische und/oder genetische Modulationen auf das Spermiengenom induziert. Ziel dieser Studie war es, zunächst die Wirkung von Tabakrauch auf die Spermienqualität zu ermitteln.Die Spermienqualität wurde bestimmt durch Standardparameter (WHO, 2010), die DNA-Integrität (gemessen mit Chromomycin A3 Färbung, CMA3) und die DNAFragmentierung (gemessen durch den TUNEL-Test). Des Weiteren wurde das klinische Outcome nach ICSI Therapie dokumentiert. Transkriptionswerte von fünf atomaren Proteingenen wurden ebenfalls quantifiziert: H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1 und PRM2 von RT-PCR.Es wurde untersucht, ob die Gene mit den bisherigen Parametern korrelieren und ob es einen Effekt des Rauchens auf die Genexpression, bzw. Genregulation gibt. Um die einzelne Nukleotid-Polymorphismen zu bestimmen, wurden 3 Gene (H2BFWT, PRM1 und PRM2) durch Sanger-Sequenzierung untersucht.Ihre Assoziation mit dem Rauchen, sowie mit den anderen Spermienparametern wurde ebenfalls gemessen. Die Studienpopulation (n=167) waren männliche Probanden, die sich einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) unterzogen hatten. Das Alter betrug 25-49 Jahre. Die Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt: Die Gruppe der schweren Raucher und die Nichtraucher-Gruppe. Bei der Gruppe der Raucher wurde eine signifikante Abnahme (p<0,01) bei den Standardparametern im Vergleich zu Nichtrauchern gezeigt: Spermienkonzentration (62,17 ± 51,68 mill/ml vs. 88,09 ± 63,42 mill/ml), progressive Beweglichkeit (PR) (14,86 ± 10,95% vs. 27,31 ± 21,78%) und Spermienmit normaler Morphologie (4,01 ± 2,88% vs. 10,87 ± 12,11%) waren bei Rauchern im Vergleich zu den Nichtrauchern reduziert. Außerdem war der Mittelanteil von Protamin-Mangel (CMA3-Positivität) und der DNAFragmentierung von Spermien (sDF) bei Rauchern signifikant höher (p<0,01) als bei Nichtrauchern (33,30 ± 23,33% vs. 20,35 ± 13,43% und 26,86 ± 19,77% vs. 14,23 ± 13,07%). Es wurde eine signifikante, positive Korrelation zwischen die CMA3-Positivität und sDF (r=0,484; p=0,0001) in der Gruppe der Raucher festgestellt. Dagegen gab es keine Korrelation (r=0,256; p=0,098) zwischen diesen beiden Parametern in der Nichtraucher- Gruppe. In der vorliegenden Studie war die Schwangerschaftsrate nach ICSI in der Gruppe der Nichtraucher deutlich höher als die der Raucher-Gruppe (0,60 ± 0,49% vs 0,38 ± 0,48%; p=0,013). Darüber hinaus wurde die Transkriptionsstufe jedes untersuchten Gens mRNA (mean delta ct) zwischen den Rauchern und Nichtrauchern differenziert ausgedrückt.Dieser Unterschied war signifikant (p<0,01). Die Gene H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1 und PRM2 wurden in Spermien der Raucher im Vergleich zum Nichtraucher (Foldchange<0,5) herunterreguliert und signifikant miteinander korreliert (p<0,01). Zudem lag das Protamin-MRNAVerhältnis in der Raucher-Gruppe deutlich höher (0,11 ± 0,84 vs. 0,60 ± 1,08, p=0,001). In der Gruppe der Nichtraucher korrelierte das Protaminsverhältnis positiv mit den Ausdruckstufen TNP2 (r=0,349; p=0,032) und PRM2 (r=0,488; p=0,001). In der Gruppe der Raucher korrelierte es jedoch positiv mit TNP2-Transkript (r=0,307; p=0,004), PRM2- Transkript (r=0,445; p=0,0001) und H2BFWT-Transkript (r=0,342; p=0,001). Nur in der Gruppe der Raucher korreliert das Protaminsverhältnis signifikant mit CMA3-Positivität (r=0,413; p=0,0001) und sDF (r=0,302; p=0,003). Darüber hinaus hat die vorliegende Studie gezeigt, dass es keinen Zusammenhang zwischen genetischen Variationen gibt, die im H2BFWT-Gen (rs7885967, rs553509 und rs578953), Protaminen-Gen PRM1 (rs737008) und PRM2 (rs2070923 und rs1646022) vorkommen. Zusammenfassend haben die Ergebnisse dieser Studie gezeigt, dass Rauchen einen negativen Einfluss auf die Spermienqualität hat.Die Spermienqualität, die mRNAExpressionsstufen der H2BFWT, TNP1, TNP2, PRM1-und PRM2-Gene und das ProtaminmRNA- Verhältnis waren bei Nichtrauchern reduziert, hatten aber keine Auswirkungen auf die Nukleotid-Sequenzen dieser Gene. Dies deutet darauf hin, dass die RNA der untersuchten Gene, sowie das Protamin-mRNA-Verhältnis in den Spermien männlicher Partner von ICSI-Patienten gute Vorhersage-Faktoren sind, um die Spermienqualität und ihre Fertilität zu bewerten.