ER-mitochondria contacts regulate a redox-driven signaling axis to control melanoma progression

Abstract

Melanoma is the deadliest skin cancer with an increasing incidence in the past decades. The reactive oxygen species (ROS) and dysregulation of signaling pathways play important roles in the formation and progression of melanoma. Furthermore, the oxidative stress response and activation of alternative signaling pathways were reported as determinants of drug resistance, survival and metastasis of melanoma. There is abundant scientific literature demonstrating that the oxidative stress can influence multiple signaling pathways in melanoma and in return, the changes of these signaling pathways often lead to an altered ROS production or antioxidant capacity. Hence, understanding of the interaction between ROS and the redox regulation of signaling pathways could provide beneficial insights for treatment. Mitochondria are organelles wherein the oxidative phosphorylation produces ATP as well as ROS as byproducts. Due to the proximity to the endoplasmic reticulum (ER), mitochondria also play a critical role in the regulation of intracellular calcium and the fine-tuning of the calcium-controlled signal cascades. Therefore, there are culminating evidences suggesting that mitochondria act as hubs of biogenesis, redox regulation and calcium signaling thereby controlling cellular function. Anomalies in mitochondrial function contribute to carcinogenesis of melanoma. Additionally, the reprogramming and positioning of mitochondria were shown as important factors in controlling cell survival and resistance against treatment in cancer including melanoma. We investigated how the disturbance of contact sites between mitochondria and ER through manipulation of thioredoxin related transmembrane protein 1 (TMX1) and thioredoxin related transmembrane protein 3 (TMX3), oxidoreductases localized in the mitochondria-associated ER membrane (MAM) affect the mitochondrial function, cell signaling and melanoma pathobiology. In the present study, TMX1, TMX3 and a calcium/calcineurin-regulated transcription factor Nuclear Factor of Activated T-cells 1 (NFAT1) demonstrated up-regulated expression in the melanoma cell lines and patient samples compared with healthy melanocytes and keratinocytes. The knockdown of TMX1 and TMX3 resulted in an elevated ROS via mitochondria and NAD(P)H oxidase 4 (NOX4) and NFAT1 inhibition via oxidation of the phosphatase calcineurin. The inhibition of NFAT1 led to a lower NFAT1 transcriptional activity, which affected expression of the target genes. Inhibition of NFAT1 eventually caused a suppression of melanoma proliferation, migration in vitro and tumor growth in vivo. In conclusion, our study suggests that mitochondria-ER contact sites regulate melanoma redox homeostasis and influence calcineurin-NFAT1 signaling pathway. TMX and NFAT1 are thus potential biomarkers contributing to the progression of melanoma.

Melanom ist die tödlichste Form von Hautkrebs und trat mit steigender Prävalenz in den vergangenen Jahrzehnten auf. Bei der Entstehung und dem Verlauf dieser Krebserkrankung spielen reaktive Sauerstoff Spezies (ROS), sowie die Dysregulation von Signalwegen eine wichtige Rolle. Außerdem führen die oxidative Stressantwort, sowie die Aktivierung von alternativen Signalwegen häufig zu Behandlungsesistenzen und einem erhöhten Metastasierungspotential, was Auswirkungen auf das Patientenüberleben hat. Zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten konnten den Einfluss von oxidativem Stress auf verschiedene Signalwege in Schwarzem Hautkrebs nachweisen. Diese Signalwege können auf der anderen Seite wieder zu einer veränderten ROS Produktion oder antioxidativen Kapazität führen. Daher kann das bessere Verständnis der Interaktion von ROS und Redoxregulation von Signalwegen neue Einblicke in Behandlungsmöglichkeiten geben und diese verbessern. Die Mitochondrien sind wichtige Zellorganellen, in denen durch oxidative Phosphorylierung ATP, sowie als molekulares Nebenprodukt ROS produziert werden. Durch die Nähe zum ER (Endoplasmatisches Retikulum) spielen Mitochondrien auch eine bedeutende Rolle in der Regulation von intrazellulärem Calcium und dem Feintuning nachfolgender Signalkaskaden. Es deutet viel darauf hin, dass Anomalien in den Mitochondrien, die im Mittelpunkt von Biogenese, Redoxregulation und Kontrolle von Signalwegen stehen, zur Melanomentstehung beitragen. Zusätzlich beeinflussen die Reprogrammierung, sowie Positionierung der Mitochondrien das Zellüberleben, sowie die Resistenzbildung gegenüber Therapien bei Krebs, eingeschlossen dem Melanom. Daher haben wir in diesem Zusammenhang untersucht, wie die Veränderung von Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und ER durch TMX1 und TMX3, den Oxidoreduktasen in der Mitochondrien assozierten ER Membran (MAM), die Funktion der Mitochondrien, von Zellsignale und die Melanom-Pathologie beeinflussen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass TMX1, TMX3 und der Calcium/Calciumneurin-regulierte Transkriptionsfaktor NFAT1 im Vergleich zu Melanozyten und Keratinozyten in Melanom Zelllinien und Patientenproben überexprimiert sind. Der Knockdown von TMX1 und TMX3 führte durch einen Anstieg an mitochondiralen ROS, sowie einer erhöhten NAD(P)H Oxidase 4 (NOX4) Aktivität, zu einem Anstieg von ROS im Zytosol. Dadurch wurde die Translokation von NFAT1 in den Zellkern durch die Oxidation der Phosphatase Calcineurin verhindert. Durch die Inhibition der NFAT1-Aktivierung und die daraus folgende geringere transkriptionale Aktivität, wurde die Expression von Zielgenen beeinflusst. Die Inhibition von NFAT1 verursachte schließlich eine Hemmung der Melanomproliferation, der Migration in vitro und des Tumorwachstums in vivo. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Mitochondrien-ER-Kontaktstellen die Melanom-Redox-Homöostase regulieren und den Signalweg von Calcineurin-NFAT1 beeinflussen. TMX und NFAT1 sind daher potenzielle Biomarker, die zur Melanomprogression beitragen.