Characterization and selective manipulation of GnRHR-expressing neurons in the periaqueductal gray of female mice (Mus musculus, Linnaeus 1758)

Abstract

The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is the main regulator of reproductive physiology in vertebrates. GnRH is released by a small subset of hypothalamic neurons. In the pituitary gland it acts on gonadotropes, which selectively express the Gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR). The GnRHR signal in gonadotrope cells is then crucial for gonadal function and thus fertility. Furthermore, classical studies in rats indicated that GnRH strongly facilitates female sexual behavior, by acting directly in the brain. In particular, GnRH infusions within the dorsal periaqueductal gray (PAG) augmented female sexual receptivity. Previously our lab has generated a mouse model that allowed for the reliable visualization of the neural targets of GnRH, via Cre-dependent expression of τGFP in GnRHR-expressing cells. GnRHR neurons are widely present in the male mouse brain in areas involved in sex-specific behaviors, including the PAG. Furthermore, GnRH could elicit calcium responses and modulate firing activity in GnRHR neurons. However, the role of GnRHR neurons in behavior remained unexplored. By using the same binary genetic approach, I first aimed to describe the GnRHR network in the PAG of the female mouse in age-matched groups. I found a wide distribution of GnRHR neurons specifically in the dorsal and lateral parts of the PAG, but not in the ventrolateral PAG. Furthermore, the number of GnRHR neurons increased during age, suggesting a late establishment of the GnRHR network within the PAG. Secondly, I aimed to genetically ablate GnRHR neurons in the dorsal PAG. In order to do that, I injected in the dorsal PAG an adeno-associated virus that mediates cre-dependent expression of a constitutively active form of caspase-3. In this way, I could induce programmed cell death only in PAG-GnRHR neurons. Surprisingly, ablation did not affect female sexual receptivity. Moreover, I investigated GnRHR neural activity following female sexual behavior by using the marker c-fos. I found a strong c-fos up-regulation in the PAG, but not in GnRHR neurons. In a parallel study I have explored the role of metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) in the initiation of puberty. The neuroendocrine mechanisms that regulate the initiation of puberty have been largely explored but still poorly understood. Evidence revealed a role of glutamate in the regulation of GnRH neurons. Female VII mice lacking the metabotropic receptor 5 (mGluR5) gene exhibited delayed puberty and reduced fertility. To analyze gonadotropin function in the absence of mGluR5 I analyzed the whole pituitary hormone serum profiles. I found reduced levels of follicle stimulating hormone but not luteinizing hormone, together with higher thyroid-stimulating hormone levels in female mice lacking the mGluR5 gene. These results could provide new insights into the mechanisms that can regulate fertility and help to develop new therapies for puberty disorders.

Das Gonadotropin-freisetzendes Hormon (GnRH) ist der Hauptregler der Fortpflanzungsphysiologie bei Wirbeltieren. GnRH wird von einer kleinen Untergruppe von Hypothalamus Neuronen freigesezt. In die Hypophyse es auf gonadotrope zellen wirkt, die selektiv den Gonadotropin freisetzenden Hormonrezeptor (GnRHR) exprimieren. Das GnRHR-Signal in den gonadotrope zellen ist dann entscheidend für die Gonadenfunktion und damit die Fruchtbarkeit. Darüber hinaus haben klassische Studien an Ratten gezeigt, dass GnRH das weibliche Sexualverhalten fördert, da es direkt im Gehirn wirkt. Insbesondere verstärken GnRH-Infusionen im dorsalen periaqueduktalen Grau (PAG) die weibliche sexuelle Empfänglichkeit. Zuvor wurde in unserem Labor ein Mausmodell erzeugt, dass die zuverlässige Visualisierung der neuronalen Ziele von GnRH über Cre-abhängige Expressionen von τGFP in GnRHR-exprimierenden Zellen erlaubt. GnRHR Neuronen sind weit verbreitet in Bereichen des Gehirns der männlichen Maus, die an geschlechtsspezifischem Verhalten beteilgt sind, einschließlich des PAG. Darüber hinaus konnte GnRH eine Erhöhung des intrazellularen Kalzium induzieren und die Frequenz der Aktionspotentiale in GnRHR-Neuronen modulieren. Die Rolle von GnRHR-Neuronen im Verhalten blieb jedoch unerforscht. Durch die Verwendung des gleichen binären gentischen Ansatzes, hatte ich zunächst das Ziel, das GnRHR Netzwerk in dem PAG des weiblichen Gehirns der Maus bei gleichaltrigen Gruppen zu beschreiben. Ich fand eine breite Verteilung der GnRHR Neuronen spezifisch in der dorsalen und den seitlichen Teilen des PAG, jedoch nicht in dem ventrolateralen PAG. Darüber hinaus nimmt die Anzahl der GnRH Neuronen mit dem Alter zu, was auf eine späte Errichtung des GnRHR-Netzes in das PAG hindeutet. Des weiteren versuchte ich die genetische Ablation von GnRHR Neuronen im dorsalen PAG. Um dies zu tun, injizierte ich ein Adeno-assoziierten Virus im PAG, der die cre-abhängige Expression einer konstitutiv aktiven Form von Caspase-3 vermittelt. Auf diese Weise konnte ich den programmierten Zelltod in den PAG-GnRHR-Neuronen induzieren. Überraschenderweiße beeinflusste die Ablation die weibliche sexuelle Empfänglichkeit nicht. Darüber hinaus habe ich die Aktivität der GnRH Neurone in Bezug auf das weibliche Sexualverhalten mit dem Marker c-fos untersucht. Ich fand eine stark hochregulierte c-fos Aktivität im PAG, jedoch nicht in GnRHR Neuronen. V In einer parallelen Studie untersuchte ich die Rolle des metabotropen Rezeptors 5 (mGluR5) beim Einstzen der Pubertät. Die neuroendokrinen Mechanismen, die den Beginn der Pubertät regulieren, werden weitgehend erforscht, sind aber immer noch unzureichend verstanden. Beweis dafür zeigte die Rolle von Glutamat bei der Regulation von GnRH-Neuronen. Weibliche Mäuse, denen das metabotrope Rezeptor 5 (mGluR5) Gen fehlte, zeigten einen verzögerte Pubertät und eine verminderte Fertilität. Zur Analyse der Gonadotropinfunktion in Abwesenheit von mGluR5 analysierte ich die Serumprofile der gesamten Hypophysenhormone. Ich fand reduzierte Mengen von Follikel-stimulierenden Hormones, jedoch blieb die Menge von luteinisierenden Hormones gleich. Beim Hormonspiegel von Schilddrüsenstimulierenden Hormones bei weiblichen Mäusen, denen das mGluR5-Gen fehlte, konnte ich jedoch einen Anstieg feststellen. Diese Ergebnisse könnten neue Einsichten in die Mechanismen liefern, die die Fruchtbarkeit regulieren und helfen kann dazu beitragen, neue Therapien für Pubertätsstörungen zu entwickeln.