Biotechnological application of steroidogenic cytochromes P450

Abstract

Synthetic glucocorticoids are of high pharmaceutical value due to their anti-inflammatory and immunosuppressive effects. The low-yield chemical synthesis of glucocorticoids consists of multiple steps and includes toxic compounds as well as unwished by-product formation. Thus, one intends to replace this process by a more sustainable biocatalytic alternative. The work presented here demonstrates an enzyme-mediated approach to produce the synthetic glucocorticoid premedrol, a precursor of methylprednisolone (medrol), by a one-step hydroxylation at carbon atom 21catalyzed by bovine CYP21A2, which belongs to the protein superfamily of cytochromes P450. Therefore, a CYP21A2-based whole-cell system was established, by which a maximum yield of 0.65 g/L premedrol could be achieved - a promising perspective for an industrial application. With regard to a molecular evolution of CYP21A2 as well as an elucidation of the biocatalytic ability of orphan CYPs in a high-throughput microtiter scale, the indole-deficient Escherichia coli strain C43(DE3)_∆tnaA was generated, since indole is an inhibitor of some CYPs and massively impedes a screening. Applying C43(DE3)_∆tnaA in biotransformation resulted in a significantly higher product formation in case of CYP21A2 as well as of CYP264A1 from the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 and thus, serves as convenient host in future screening procedures.

Synthetische Glucocorticoide sind aufgrund ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung von hohem pharmazeutischem Wert. Die chemische Synthese von Glucocorticoiden besteht aus mehreren Schritten und beinhaltet die Verwendung toxischer Substanzen als auch die Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Daher soll dieser Prozess durch ein nachhaltigeres biokatalytisches Verfahren ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit demonstriert eine biokatalytische Herangehensweise zur Produktion des synthetischen Glucocorticoids Premedrol, einem Vorläufer von Methylprednisolon (Medrol), durch eine einstufige Hydroxylierung am C21, welche durch das zur Proteinsuperfamilie der Cytochrome P450 gehörende steroidogene bovine CYP21A2 katalysiert wird. Daher wurde ein CYP21A2-basiertes Ganzzellsystem etabliert, mit Hilfe dessen eine maximale Premedrolausbeute von 0,65 g/l erzielt werden konnte – eine vielversprechende Perspektive im Hinblick auf eine industrielle Anwendung. Hinsichtlich einer molekularen Evolution von CYP21A2 und einer Aufklärung des biokatalytischen Potentials unbekannter CYPs durch ein Hochdurchsatz-Screening wurde der Indol defiziente Escherichia coli Stamm C43(DE3)_∆tnaA generiert, da Indol einige CYPs inhibiert und somit ein Screening erschwert. Ein Umsatz mit C43(DE3)_∆tnaA resultierte in einer signifikant höheren Produktbildung im Falle des CYP21A2 und des CYP264A1 aus Sorangium cellulosum So ce56 und ist somit ein geeigneter Wirtsorganismus für künftige Screeningverfahren.