Auswirkungen der MAE1-Gendeletion auf den Zentralstoffwechsel von Saccharomyces cerevisiae unter verschiedenen Physiologien

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Deletion des MAE1-Gens auf den zentralen Metabolismus von S. cerevisiae untersucht. Im Zentrum stand die Analyse des Fluxoms beider Stämme unter verschiedenen physiologischen Zuständen. Vergleichenden Studien zwischen einem Referenzstamm und dem MAE1-Deletionsstamm resultierten in einer starken Beeinflussung der Flussverteilungen, sowohl im Pentosephosphatweg, als auch im Citratzyklus. Ferner wurde deutlich, dass NADPH in den Zellen akkumuliert, wodurch ein alternativer Weg zur Reoxidation, neben der Biomassebildung, notwendig ist. Die Deletion des MAE1-Gens resultierte also in einer Umstrukturierung der NADPH-Bereitstellung für den Anabolismus. Die aus der 13C metabolischen Flussanalyse erhaltenen Daten wurden mit Ergebnissen aus in vitro Aktivitätsbestimmungen zentraler Enzyme, sowie den intrazellulären Verhältnissen von NAD(P)+ und NAD(P)H korreliert, um Aussagen über die Aktivität und Regulierung der einzelnen Stoffwechselwege unter den jeweiligen Zuständen machen zu können. Daneben wurde mittels der Elementarmodenanalyse eine in silico Betrachtung des zellulären Stoffwechsels durchgeführt. Ausgehend von einem Genom-weiten Modell des Stoffwechsels wurde dazu ein reduziertes Modell erstellt. Dies resultierte, neben diversen anderen Optionen, auch in der Notwendigkeit einer alternativen Reoxidationsmöglichkeit für NADPH außer der Biomassebildung, nämlich einen Transhydrogenase-ähnlichen Zyklus, um die mittels 13C metabolischer Flussanalyse bestimmten Flussverteilungen zu erhalten.

This work yields towards the quantitative description of the influence of MAE1 gene deletion on the overall cellular metabolism of S. cerevisiae. Focusing on the fluxome of both strains under different physiological and metabolic states, the MAE1 gene deletion had a strong impact on the way carbon distributes throughout the metabolic network. Comparative studies using a reference strain and a MAE1 deletion strain showed a significant impact on the flux through pentose phosphate pathway and the citric acid cycle. It was obvious that an accumulation of NADPH occurred in all the metabolic states which made an alternative system of reoxidation, beside the formation of biomass, necessary. Therefore MAE1 gene deletion resulted in a complete restructuration of the way NADPH is supplied by the central metabolism. The data gained from 13C metabolic flux analysis was correlated with results from in vitro enzyme activity determinations and intracellular ratios of NAD(P)+ and NAD(P)H, to comment on the activity and regulation of the single pathways under different physiological states. Additionally an elementary mode analysis was carried out. Starting from a genome scale metabolic model a more condensed network was applied. The in silico metabolic network analysis also resulted in the need for an alternative reoxidation system for NADPH to achieve the metabolic flux distribution observed by 13C metabolic flux analysis. This was implemented as a transhydrogenase-like cycle.