Monoschichten funktioneller Cellulosederivate als Schnittstellen zu biologischen Systemen

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese wasserlöslicher funktioneller Cellulosederivate und die Anwendung deren Monoschichten auf Gold (Au), Silber (Ag) und Silizium (Si)-Oberflächen zum Aufbau von Immun- bzw. Enzymsensoren. Die hergestellten wasserlöslichen Cellulosederivate besitzen zwei Funktionalitäten: zum einen Thioankergruppen (Thioether, Thiosulfate) für die Anbindung an Gold-, und Silberoberflächen, zum anderen reaktive Gruppen für die Anbindung an Siliziumoberflächen bzw. an die biologisch aktive Komponente. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Synthesen der Thioether- und Thiosulfat-carboxymethylcellulosen, MTh-CMC respektive HTSHP-CMC, hinsichtlich der Regioselektivität, der Erhöhung der Anzahl an Thioankergruppen und der Reproduzierbarkeit der Synthesen, optimiert. Darüber hinaus wurde eine verbesserte Methode zur Synthese der Bisthiosulfat-carboxymethylcellulose TSHP-CMC entwickelt. Ausgehend von der CMC und den drei Thio-CMC Derivaten konnten reaktive Derivate mit anionischen (MCT),kationischen (EDC/MEDC) und neutralen (Hydrazid und NHS) Funktionalitäten synthetisiert werden. Die Abscheidung von MTh-CMC, TSHP-CMC, HTSHP-CMC und deren reaktiven Analoga auf Au-Oberflächen wurde in situ mittels Oberflächenplasmonenresonanz-spektroskopie (SPR) untersucht. Die ermittelten Schichtdicken (d) und Oberflächen-belegungen (Γ) der Derivate liegen zwischen d = 1.2-2.5 nm, entsprechend Γ = 1.19-2.49 mg/cm2. Mit Hilfe oberflächenanalytischer Methoden konnten Aussagen über die chemische Zusammensetzung (FTIR), Hydrophilie (Kontaktwinkel) und Belegungs-dichte (CV-/EIS) der adsorbierten Monoschichten getroffen werden. Die Monoschichten der Thio-CMC und reaktiven Thio-CMC auf Ag-Oberflächen zeigen höhere Schichtdicken wie auf Gold aufgrund der Bildung einer Oxidschicht vor und während der Beschichtung mit den Cellulosederivaten. Durch die sehr guten Passivierungseigenschaften der Cellulosederivate eignen sich diese zur antikorrosiven Beschichtung von Silbergegenständen. Der Aufbau von Monoschichten auf Si- und Glasoberflächen erfolgte durch die Reaktion der MCT-CMC aus wässriger Lösung mit den APES (3-Aminopropyltriethoxysilan) funktionalisierten Si- bzw. Glasoberflächen. Die durch Ellipsometrie ermittelte Schichtdicke für die MCT-CMC (3.46 nm) auf Silizium ist in guter Übereinstimmung mit den Schichtdicken der Monoschichten auf Gold. Die reaktive TSHP-CMC-NHS konnte erstmals zum kovalenten Aufbau eines BSA (Bovine Serum Albumine)—Immunsensors auf Gold eingesetzt werden. Die SPR-Untersuchung der konsekutiven Bindungsexperimenten mit anti-BSA erlaubte die Bestimmung einer Assoziationskonstante von Ka,app. = 5.40 x 106 M-1, die in guter Übereinstimmung mit literaturbekannten Werten ist. Erstmals gelang auch der Aufbau eines anti-BSA-Immunsensor auf einer mit MCT-HTSHP-CMC beschichteten Ag-Oberfläche. Regenerative Bindungsexperimente mit BSA konnten mehrmals wiederholt und mittels SPR-Spektroskopie verfolgt werden. Die Monoschichten der reaktiven MCT-TSHP-CMC und MCT-CMC konnten zur kovalenten reagenzfreien Kupplung der Meerrettichperoxidase (HRP) an Au- bzw. Si-Oberflächen eingesetzt werden. Aus den Michaelis-Menten Kinetiken der immobilisierten HRP wurden KM-Werte von 2 mM (HRP auf Au) bzw. 0.6 mM (HRP in FuSi-Kapillaren) berechnet, die auf einen geringen bzw. keinen Verlust der Aktivität der HRP durch Immobilisierung hindeuten. Die immobilisierte HRP zeigt eine gute Langzeitstabilität der Aktivität und sehr gute Thermo- und Lagerstabilität. Ein kompetitives Assay ermöglichte des Weiteren die Bestimmung von Inhibitionskonstanten (Pseudo-IC50-Wert). Neben einer gesteigerten Stabilität und ausgezeichneter Reproduzierbarkeit kinetischer Messungen bieten in Monoschichten integrierte Enzyme somit auch die Möglichkeit, hocheffiziente Screeningtests für Inhibitoren zu entwickeln.

The presented thesis discusses the synthesis of water soluble functional cellulose derivatives and the application of their self-assembled monolayer (SAM) on gold, silver and silicon surfaces, for the design of immune and enzyme sensors. The synthesized cellulose derivatives possess two functionalities: thio-anchor groups (thiosulfate, thioether) for the binding on gold and silver surfaces and reactive groups for the deposition on silicon surfaces and for the binding of biomolecules respectively. Within this work the synthesis of thioether and thiosulfate carboxymethylcelluloses, MTh-CMC and HTSHP-CMC respectively, were optimized with respect to regioselectivity, increase of the number of thio-anchor groups and reproducibility of this synthesis. Furthermore an improved method was developed for the synthesis of the bisthiosulfate carboxymethylcellulose derivative TSHP-CMC. Starting with CMC and the three thio CMC derivatives, reactive derivatives with anionic (MCT), cationic (EDC/MEDC) and neutral (hydrazides and NHS) functionalities could be synthesized. The SAM formation of the thio CMC and their reactive analogues on gold surfaces was investigated in situ by means of surface plasmon resonance spectroscopy (SPR). The determined layer thicknesses (d) and surface densities (Γ) of these derivatives on gold are between d = 1.2-2.5 nm, accordingly Γ = 1.19-2.49 mg/cm2. Using surface-analytical methods, information on the chemical composition (FTIR), hydrophilicity (contact angle) and surface density (CV, EIS) of the adsorbed SAMs could be obtained. The monolayers of thio CMC and reactive thio CMC derivatives on silver surfaces show higher layer thicknesses as on gold due to the formation of an oxide layer, before and during the coating with the cellulose derivatives. Due to the very good passivation characteristics of these cellulose derivatives they are suitable for an anti-corrosive protection of silver objects. The SAM formation on silicon and glass surfaces took place by reacting an aqueous solution of the MCT-CMC derivative with APES (3-aminopropyl triethoxysilane) functionalized silicon and/or glass surfaces. The layer thickness for MCT-CMC (3.46 nm) on silicon surfaces has been determined by means of ellipsometry and is in good agreement with the layer thicknesses of the monolayers on gold. For the first time the reactive TSHP-CMC-NHS has been used to covalently assemble a BSA (Bovine Serum Albumin) immune sensor on gold surfaces. The SPR analysis of the consecutive binding with anti-BSA (aBSA) enabled the determination of an association constant of Ka,app. = 5.40 x 106 M-1, which is in good agreement with the values reported in the literature. The assembly of an aBSA immune sensor on an MCT-HTSHP-CMC functionalized silver surface succeeded for the first time as well. Regenerative binding experiments with BSA could be repeated several times and has been monitored by means of in situ SPR spectroscopy. The monolayers of the reactive MCT-TSHP-CMC and MCT-CMC derivatives could be used for the reagent free covalent coupling of horseradish peroxidase (HRP) on gold and/or silicon surfaces. From the Michaelis-Menten kinetics of the immobilized HRP, KM values of 2 mM (HRP on gold) and 0.6 mM (HRP in fused silica capillaries) respectively were calculated, which indicate a small or no loss of the activity of the HRP by immobilization. The immobilized HRP shows a good long-term stability of the activity and a very good storage and thermal stability. Furthermore a competitive assay allows the determination of inhibition constants (pseudo-IC50-values). Integrated enzymes on cellulose monolayers show an increased stability and excellent reproducibility of kinetic measurements and thus are offering the possibility of developing high-efficient screening tests for inhibitors.