Calciumsignale und Zytotoxizität humaner natürlicher Killerzellen

Abstract

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und natürliche Killerzellen (NK) sind wichtige Eckpfeiler bei der Abtötung von Krebszellen. Ihre Funktion wird maßgeblich durch calciumabhängige Signale reguliert. Während Calciumsignale in T-Zellen relativ gut untersucht sind, ist über deren Rolle in NK-Zellen, insbesondere während der dynamischen Interaktion und Abtötung von Krebszellen, bislang vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, Ca²⁺‑Signale in primären humanen NK‑Zellen während der Abtötung von Krebszellen auf Einzelzellebene zu untersuchen. Ferner sollte deren Bedeutung im Kontext moderner Immuntherapien, insbesondere CAR‑modifizierter NK‑Zellen, analysiert werden. Hierzu wurde zunächst ein geeignetes experimentelles System etabliert, das die simultane Messung intrazellulärer Ca²⁺‑Signale in NK-Zellen und des Zelltodes von Krebszellen in Echtzeit ermöglicht. Dabei zeigte sich, dass NK-Zellen, wie auch in der Literatur beschrieben, sehr empfindlich auf jeglichen Zellstress reagieren. Ein zentraler methodischer Bestandteil war daher die Auswahl eines geeigneten Ca²⁺‑Indikators für primäre NK‑Zellen. Der häufig verwendete Standardfarbstoff Fura‑2 wies zwar einen großen dynamischen Bereich auf, führte jedoch aufgrund der erforderlichen UV‑Anregung mit Wellenlängen bis zu 340 nm zu einer signifikanten Beeinträchtigung der NK‑Zell‑Zytotoxizität. Durch den systematischen Vergleich verschiedener Fura‑Derivate konnte Fura‑10 als geeigneter Kompromiss zwischen Signalqualität, Stabilität und geringer Phototoxizität identifiziert werden. In Kombination mit dem pCasper-System zur Detektion von Zielzellapoptose und -nekrose wurde dieser Ansatz um die gleichzeitige Erfassung des Zielzellschicksals erweitert. Die Analyse primärer NK-Zellen zeigte, dass verschiedene Formen der Zielzellabtötung, darunter Apoptose und Nekrose, mit charakteristischen Ca²⁺-Signaldynamiken assoziiert sind. Ein transientes Ca2+-Signal ist notwendig für zytotoxische Prozesse, jedoch nicht hinreichend für eine erfolgreiche Zielzellabtötung. Ein klarer Schwellenwert zur Unterscheidung zwischen erfolgreichen und ineffizienten Interaktionen konnte nicht identifiziert werden. Stattdessen deuten die Daten auf ein probabilistisches Modell hin, in dem die Höhe des Ca²⁺‑Signals die Wahrscheinlichkeit eines Zytotoxizitätsereignisses moduliert, ohne dessen Ausgang deterministisch festzulegen. Im Gegensatz dazu ist die Dauer des Ca²⁺‑Signals eng mit dem Verlauf des Abtötungsprozesses verknüpft. Schnell verlaufende nekrotische Ereignisse gehen mit einer raschen Abnahme des Ca²⁺‑Signals einher, während langanhaltende Kontakte ohne Zytotoxizität durch persistierende Ca²⁺‑Signale gekennzeichnet sind. Dies legt nahe, dass die Terminierung von Ca²⁺‑Signalen nicht primär durch intrinsische Programme der NK‑Zelle gesteuert wird, sondern durch Rückkopplungssignale der Zielzelle beeinflusst ist. Die Untersuchung CAR‑modifizierter NK‑Zellen belegte, dass die Expression eines CD19‑spezifischen CAR die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Zielzellabtötung deutlich erhöht. Gleichzeitig bleiben die grundlegenden Mechanismen der calciumabhängigen NK‑Zell‑Zytotoxizität erhalten. CAR NK‑Zellen weisen erhöhte Ca2+-Signale bei antigenabhängigen Interaktionen auf, während basale Ca²⁺‑Spiegel und die Abklingkinetik unverändert bleiben, verglichen mit untransfizierten NK-Zellen. Dies spricht dafür, dass die CAR‑Signaltransduktion primär die Aktivierungsschwelle verschiebt, ohne die zugrunde liegenden Effektorprogramme zu verändern. Auch die natürliche, CAR-unabhängige Zytotoxizität bleibt erhalten. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern somit ein konsistentes Modell, in dem Ca²⁺‑Signale als regulatorische Größe fungieren, die die Wahrscheinlichkeit zytotoxischer Entscheidungen beeinflusst, während die konkrete Ausführung der Zielzellabtötung durch zusätzliche Faktoren bestimmt wird. Dieses Modell lässt sich sowohl auf primäre NK‑Zellen als auch auf CAR NK‑Zellen übertragen. Über die grundlegenden mechanistischen Erkenntnisse hinaus haben die Ergebnisse auch translationalen Charakter. Die Beobachtung, dass CAR NK‑Zellen ihre natürliche calciumabhängige Regulation beibehalten und keine globale Hyperaktivierung zeigen, unterstreicht ihr Potenzial als sichere Alternative zu CAR T‑Zellen. Die Ergebnisse betonen zudem die Notwendigkeit eines vertieften Verständnisses intrazellulärer Ca²⁺‑Dynamiken, um deren gezielte Modulation als potenziellen therapeutischen Ansatz bewerten zu können.

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK cells) are key effector cells in the elimination of cancer cells. Their function critically depends on calcium-dependent signal transduction. While calcium signaling in T cells has been studied extensively, comparatively little is known about its role in NK cells, particularly during dynamic interactions with target cells and the process of cancer cell killing. The aim of this work was therefore to investigate Ca²⁺ signals in primary human NK cells during the killing of cancer cells at the single-cell level. Furthermore, their relevance in the context of modern immunotherapies, in particular CAR-modified NK cells, was analyzed. To this end, an experimental system was initially established that enables the simultaneous measurement of intracellular Ca²⁺ signals in NK cells and target cell death in real time. It was found that NK cells, as also described in literature, are highly sensitive to any form of cellular stress. A central methodological component was therefore the selection of a suitable Ca²⁺ indicator for primary NK cells. The commonly used standard dye Fura-2 exhibited a large dynamic range but led to a significant impairment of NK cell cytotoxicity due to the required UV excitation at wavelengths up to 340 nm. Through the systematic comparison of various Fura derivatives, Fura-10 was identified as a suitable compromise between signal quality, stability, and low phototoxicity. In combination with the pCasper system for the detection of target cell apoptosis and necrosis, this approach was extended to include simultaneous assessment of target cell fate. The analysis of primary NK cells showed that different types of target cell killing, including apoptosis and necrosis, are associated with characteristic Ca²⁺ signal dynamics. A transient Ca2+ signal is necessary for cytotoxic processes but not sufficient for successful target cell killing. A clear threshold to distinguish between successful and inefficient interactions could not be identified. Instead, the data suggest a probabilistic model in which the amplitude of the Ca²⁺ signal modulates the probability of a cytotoxic event without deterministically defining its outcome. In contrast, the duration of the Ca²⁺ signal is closely linked to the course of the killing process. Fast necrotic events are associated with a rapid decline of the Ca²⁺ signal, whereas long-lasting contacts without cytotoxicity are characterized by persistent Ca²⁺ signals. These observations suggest that the termination of Ca²⁺ signals is not primarily controlled by intrinsic programs of the NK cell but is influenced by feedback signals from the target cell. The investigation of CAR-modified NK cells showed that the expression of a CD19-specific CAR significantly increases the probability of successful target cell killing. At the same time, the fundamental mechanisms of calcium-dependent NK cell cytotoxicity remain preserved. CAR NK cells exhibit increased Ca2+ signals during antigen-dependent interactions, while basal Ca²⁺ levels and decay kinetics remain unchanged compared to untransfected NK cells. This suggests that CAR signaling primarily shifts the activation threshold without altering the underlying effector programs. Natural, CAR-independent cytotoxicity is also preserved. The results of this work therefore provide a consistent model in which Ca²⁺ signals function as a regulatory parameter that influences the probability of cytotoxic decisions, while the actual execution of target cell killing is determined by additional factors. This model can be applied to both primary NK cells and CAR NK cells. Beyond the fundamental mechanistic insights, the results also have translational character. The observation that CAR NK cells retain their natural calcium-dependent regulation and do not exhibit global hyperactivation highlights their potential as a safer alternative to CAR T cells. The results further emphasize the need for a deeper understanding of intracellular Ca²⁺ dynamics in order to evaluate their targeted modulation as a potential therapeutic approach.