Ca2+-dependent mechanisms of ADAM10 activation in non-excitable cells

Abstract

A disintegrin and metalloproteinase is a family of zinc-dependent metalloproteinases that primarily act on the cellular surface, cleaving their substrates near the surface in a process called shedding. Among their members, ADAM10 is an important metalloproteinase mostly known for its participation in Notch signaling.. Some of its most prominent substrates are the adherens junction(AJ)-forming molecule E-cadherin and the epidermal growth factor betacellulin. It has been proposed that intracellular Ca2+ increases can promote the activation of ADAM10 since a stimulation of different cell lines with ionophores like ionomycin has led to an augmentation of ADAM10 activity. Due to ADAM10's involvement in pathologies such as AD, cancer development, acute inflammatory responses and pathogen entry, a deeper understanding of ADAM10 regulation through Ca2+ is crucial for more effective treatment of these conditions. To investigate the Ca2+ dependent activation of ADAM10 in more detail, ionomycin, trifluoperazine and ophiobolin A as reagents promoting different manners of Ca2+ entry were tested for their ADAM10 activation. Their effects were further investigated under Ca2+ free conditions and intracellular Ca2+ sequestration to determine the origin of these activating Ca2+ ions. Furthermore, time- and threshold dependence were investigated using increasing concentrations of ionomycin and a minimal concentration of ionomycin resulting in intracellular Ca2+ increase. In parallel, the effect of these stimulations on membrane-unbound forms and non-cell associated forms such as in exosomes contribute to the activity promotion observed under these conditions. The mentioned stimuli are artificial stimuli. Physiological Ca2+ entry pathways would be, as one example, be represented by members of the TRP channel family, which were investigated for their effects on ADAM10 activation. As readout for the activity, the cleavage of E-cadherin was used, and its processing into different fragments was investigated in more detail using various tagged versions of E-cadherin. Finally, Pseudomonas aeruginosa infection was used as a natural stimulus, in conjunction with inhibitors of the PQS quorum sensing communication system, to assess the activation of ADAM10 and the potential involvement of Ca2+ ions under these conditions. Stimulation with ionomycin and trifluoperazine under chelating conditions or in the nominal absence of Ca2+ revealed a dependency on extracellular Ca2+ for the activation of ADAM10 when stimulated with ionomycin. However, trifluoperazine appeared to be only partially dependent on Ca2+ in promoting ADAM10 activity. Furthermore, ionomycin stimulation was found to be time-independent and to reach a Ca2+ influx threshold when utilizing a concentration of at least 0.6 µM of ionomycin. On the other hand, stimulations with trifluoperazine required longer times to achieve a significant increase in ADAM10 activity. Cell-uncoupled forms of ADAM10 were found to be activated more rapidly by trifluoperazine than by ionomycin, which correlated with the surface expression of ADAM10, also upregulated under trifluoperazine stimulation. Additionally, the release of ADAM10 in exosomes was increased in the presence of extracellular Ca2+. Furthermore, ADAM10 was activated after the opening of members of the TRPC subfamily, but not by TRPM3 as representative of the melastatin subfamily. pointing towards a potential dependence on the formation of certain microdomains. The infection with Peudomonas aeruginosa resulted in a subsequent activation of ADAM10. This was only partially reduced when the cells were infected with a pyocyanin knockout mutant and completely abrogated when inhibiting the bacteria with PQS inhibitors overnight. Although Ca2+ imaging experiments revealed a slight Ca2+ increase when infecting with Pseudomonas aeruginosa, which is ablated when using previously incubated bacteria with PQS inhibitors, different mechanisms may account for the observed activation. The opening of specific Ca2+ channels and the temporal dynamics of subsequent Ca2+ entry offers novel possibilities to target ADAM10 while circumventing detrimental side-effects of systemic inhibition.

Disintegrin und Metalloproteinas e ist eine Familie von zinkabhängigen Metalloproteinasen, die hauptsächlich auf der Zelloberfläche wirken und ihre Substrate in einem als Shedding bezeichneten Prozess nahe der Oberfläche spalten. Unter ihren Mitgliedern ist ADAM10 eine wichtige Metalloprotease, die vor allem für ihre Beteiligung an der Notch-Signalübertragung bekannt ist. Zu ihren wichtigsten Substraten gehören das Adhäsionsmolekül E-Cadherin, das Adhäsionsverbindungen (AJ) bildet, und der epidermale Wachstumsfaktor Betacellulin. Es wurde vermutet, dass ein Anstieg des intrazellulären Ca2+ die Aktivierung von ADAM10 fördern kann, da eine Stimulation verschiedener Zelllinien mit Ionophoren wie Ionomycin zu einer Steigerung der ADAM10-Aktivität geführt hat. Aufgrund der Beteiligung von ADAM10 an Pathologien wie Alzheimer, Krebsentwicklung, akuten Entzündungsreaktionen und dem Eindringen von Krankheitserregern ist ein tieferes Verständnis der Regulation von ADAM10 durch Ca2+ für eine wirksamere Behandlung dieser Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Um die Ca2+-abhängige Aktivierung von ADAM10 genauer zu untersuchen, wurden Ionomycin, Trifluoperazin und Ophiobolin A als Reagenzien, die unterschiedliche Arten des Ca2+-Eintritts fördern, auf ihre ADAM10-Aktivierung getestet. Ihre Wirkungen wurden unter Ca2+-freien Bedingungen und bei intrazellulärer Ca2+-Sequestrierung weiter untersucht, um den Ursprung dieser aktivierenden Ca2+-Ionen zu bestimmen. Darüber hinaus wurden die Zeit- und Schwellenwertabhängigkeit unter Verwendung steigender Ionomycin-Konzentrationen und einer minimalen Ionomycin-Konzentration, die zu einem Anstieg des intrazellulären Ca2+ führt, untersucht. Parallel dazu wurde untersucht, inwieweit die Wirkung dieser Stimulationen auf membrangebundene und nicht zellassoziierte Formen, wie z. B. in Exosomen, zur unter diesen Bedingungen beobachteten Aktivitätsförderung beiträgt. Bei den genannten Stimuli handelt es sich um künstliche Stimuli. Physiologische Ca2+-Eintrittswege wären beispielsweise durch Mitglieder der TRP-Kanalfamilie repräsentiert, die auf ihre Auswirkungen auf die ADAM10-Aktivierung untersucht wurden. Als Messgröße für die Aktivität wurde die Spaltung von E-Cadherin verwendet, und seine Verarbeitung zu verschiedenen Fragmenten wurde unter Verwendung verschiedener markierter Versionen von E-Cadherin genauer untersucht. Schließlich wurde eine Infektion mit Pseudomonas aeruginosa als natürlicher Stimulus in Verbindung mit Inhibitoren des PQS-Quorum-Sensing-Kommunikationssystems verwendet, um die Aktivierung von ADAM10 und die mögliche Beteiligung von Ca2+-Ionen unter diesen Bedingungen zu bewerten. Die Stimulation mit Ionomycin und Trifluoperazin unter chelatbildenden Bedingungen oder bei nomineller Abwesenheit von Ca2+ zeigte eine Abhängigkeit von extrazellulärem Ca2+ für die Aktivierung von ADAM10 bei Stimulation mit Ionomycin. Trifluoperazin schien jedoch nur teilweise von Ca2+ abhängig zu sein, um die ADAM10-Aktivität zu fördern. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Ionomycin-Stimulation zeitunabhängig war und bei Verwendung einer Konzentration von mindestens 0,6 μM Ionomycin einen Ca2+-Einstromschwellenwert erreichte. Andererseits erforderten Stimulationen mit Trifluoperazin längere Zeiten, um einen signifikanten Anstieg der ADAM10-Aktivität zu erreichen. Es wurde festgestellt, dass zellunabhängige Formen von ADAM10 durch Trifluoperazin schneller aktiviert wurden als durch Ionomycin, was mit der Oberflächenexpression von ADAM10 korrelierte, die ebenfalls unter Trifluoperazin-Stimulation hochreguliert wurde. Darüber hinaus war die Freisetzung von ADAM10 in Exosomen in Gegenwart von extrazellulärem Ca2+ erhöht. Außerdem wurde ADAM10 nach der Öffnung von Mitgliedern der TRPC-Unterfamilie aktiviert, jedoch nicht durch TRPM3 als Vertreter der Melastatin-Unterfamilie. Dies deutet auf eine mögliche Abhängigkeit von der Bildung bestimmter Mikrodomänen hin. Die Infektion mit Peudomonas aeruginosa führte zu einer anschließenden Aktivierung von ADAM10. Diese wurde nur teilweise reduziert, wenn die Zellen mit einem Pyocyanin-Knockout-Mutanten infiziert wurden, und vollständig aufgehoben, wenn die 9 Bakterien über Nacht mit PQS-Inhibitoren gehemmt wurden. Obwohl Ca2+-Bildgebungsversuche einen leichten Ca2+-Anstieg bei der Infektion mit Pseudomonas aeruginosa zeigten, der bei Verwendung von zuvor mit PQS-Inhibitoren inkubierten Bakterien abgebaut wurde, könnten unterschiedliche Mechanismen für die beobachtete Aktivierung verantwortlich sein. Die Öffnung spezifischer Ca2+-Kanäle und die zeitliche Dynamik des anschließenden Ca2+-Eintritts bieten neue Möglichkeiten, ADAM10 gezielt zu beeinflussen und gleichzeitig die nachteiligen Nebenwirkungen einer systemischen Hemmung zu umgehen.