Analytical methods for natural products characterization and chemical ecology: Metabolomics and multi-omics workflows in bacterial systems

Abstract

This thesis presents the development and application of bioanalytical strategies using RP- UPLC-HRMS combined with multi-omics and tailored in vitro assays to uncover cryptic enzymes, diverse metabolites, or to improve purification in five studies: (1) The cryogenic electron microscopy structure of the BAM–darobactin D9 complex guided derivative optimization, yielding the analogue D22 with 32-fold higher activity against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. Purification optimization increased D22 yields up to 4.6-fold. (2) Integrated omics and enzyme-activity assays addressed a potential bottleneck in darobactin maturation, identifying leader-cleaving peptidase candidates. (3) Metabolomics and in vitro reconstitution revealed biosynthetic crosstalk in Myxococcus xanthus DK1622, with Cxhal chlorinating DKxanthene precursors. (4) Untargeted metabolomics of predator–prey co-evolution showed prey-specific remodeling of the predator M. xanthus metabolome, where Sphingobium yanoikuyae strongly induced secondary metabolite production, including known antibiotics. (5) Peptidomics of supernatants from Escherichia coli and Staphylococcus aureus enabled detection and quantification of N-terminally formylated peptides, where the developed analytical setup overcame challenges of nanomolar concentrations and short peptide fragments. Across all studies, specifically tailored analytical methods proved crucial, forming the unifying theme of this work.

Diese Dissertation befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung analytischer Strategien auf Basis von RP-UPLC-HRMS, ergänzt durch multi-omics-Ansätze und gezielt konzipierte in vitro-Tests, zur Entdeckung kryptischer Enzyme und vielfältiger Metabolite sowie zur Optimierung eines Aufreinigungsprozesses in fünf Studien: (1) Die Kryo-EM-Struktur des BAM- Darobactin-D9-Komplexes diente als Grundlage für die Derivatoptimierung, woraus das Analogon D22 mit 32-fach höherer Aktivität gegen Carbapenem-resistente Acinetobacter baumannii resultierte. Eine optimierte Aufreinigung steigerte die Ausbeute von D22 bis zu 4,6-fach. (2) Integrierte Omics-Analysen und Enzymaktivitätstests adressierten einen potenziellen Engpass in der Darobactin-Reifung und identifizierten Kandidaten für die beteiligte Peptidase. (3) Metabolomics und in vitro-Rekonstruktion zeigten biosynthetische Crosstalk-Mechanismen in Myxococcus xanthus DK1622, bei denen die Halogenase Cxhal DKxanthen-Vorläufer chloriert. (4) Metabolomics-Analysen zur Räuber-Beute-Koevolution belegten eine beutespezifische Umstrukturierung des M. xanthus-Metaboloms, wobei Sphingobium yanoikuyae den Sekundärstoffwechsel stark induzierte. (5) Peptidomics-Analysen ermöglichten den Nachweis und die Quantifizierung N-terminal formylierter Peptide aus Escherichia coli und Staphylococcus aureus trotz nanomolarer Konzentrationen und kurzer Peptidfragmente.