Discovery of a novel microtubule-associated protein that plays a multifaceted role in primary cilia and midbodies

Abstract

The primary cilium is a microtubule-based organelle that serves as a signaling hub in nearly all vertebrate cells. Through changes in the ciliary proteome, it regulates downstream signaling processes important for cell-cell communication, development and tissue homeostasis. Defects in its structure or signaling function can lead to diseases, called ciliopathies. The cilium formation itself is linked to the cell cycle as it is templated by the mother centriole. Additionally, cilium formation requires a controlled coordination of microtubules (MTs), the actin cytoskeleton and vesicle trafficking. Emerging links of microtubule associated proteins (MAPs) contributing to the structural and functional integrity of cilia were drawn. Many ciliary MAPs do not exclusively localize to primary cilia but also other MT-based structures, such as centrioles. Besides the mother centriole as ciliary templating structure, also midbodies were linked to cilium formation. Given the broad disease spectrum of ciliopathies related to ciliary proteins, studying MAPs is crucial, as they influence not only cilia but also other cellular MT networks, centrioles and spindle structures. In this study I characterized a novel ciliary protein, FCAP33, which was identified through a proteomic screen of primary cilia in murine inner medullary collecting duct cells (IMCD3) cells. Microscopy revealed the localization of FCAP33 to primary cilia, basal bodies, centrioles, midbodies and the mitotic spindle. This suggested a role in MT-based structures beyond primary cilia. Further imaging-based approaches demonstrated its ability to bind to preformed MTs indicating its role as a MAP rather than being a MT inner binding protein. The microtubule association was also confirmed to the ciliary axoneme, where it potentially fulfills a stabilizing role. Additionally, FCAP33 appeared as a static component with limited mobility within the primary cilium in live cell photobleaching experiments. Functional studies revealed that overexpressed full-length FCAP33 promotes ciliary elongation whereas the overexpression of the N-terminal part of FCAP33 had a dominant negative effect, leading to shorter cilia and lower ciliation rates. Immunofluorescence and pull-down assays of full-length and short variants indicate that FCAP33 forms redox-sensitive oligomers via its N-terminus, which also plays a role in oligomerization and MT binding whereas the C-terminus might be involved in regulatory functions. This hypothesis can be supported by in silico and structural analysis of the protein. Beyond a ciliary localization FCAP33 also localizes to midbodies including the stem body region and the midbody remnant. This study introduces FCAP33 as a novel ciliary MAP with multifaceted roles in MT-based organelles by potentially regulating ciliogenesis and MT stability.

Das primäre Zilium ist ein auf Mikrotubuli basiertes Zellorganell, das in fast allen Wirbetlierzellen als Signalvermittlungszentrum gilt. Durch Veränderungen des ziliären Proteoms reguliert es nachgeschaltete Signalprozesse, die für Kommunikation, Entwicklung und Gewebehomöostase wichtig sind. Defekte in seiner Struktur oder Signalfunktion können zu Krankheiten führen, die als Ziliopathien bezeichnet werden. Die Zilienbildung selbst ist mit dem Zellzyklus verknüpft, da sie von der Mutterzentriole gesteuert wird. Darüber hinaus erfordert die Zilienbildung eine kontrollierte Koordination von Mikrotubuli (MT), des Aktinzytoskeletts und des Vesikeltransports. Es wurden neue Verbindungen zwischen Mikrotubuli assoziierten Proteinen (MAPs) und Zilien hergestellt, die zur strukturellen und funktionellen Integrität von Zilien beitragen. Viele ziliare MAPs sind nicht ausschließlich in primären Zilien lokalisiert, sondern auch in anderen MT-basierten Strukturen, wie z.B. Zentriolen. Neben der Mutterzentriole als ziliäre Grundstruktur wurden auch Midbodies mit der Zilienbildung in Verbindung gebracht. Angesichts des breiten Krankheitsspektrums von Ziliopathien, die mit ziliären Proteinen zusammenhängen, ist die Untersuchung von MAPs von entscheidender Bedeutung, da sie nicht nur Zilien, sondern auch andere zelluläre MTNetzwerke, Zentriolen und Spindelstrukturen beeinflussen. In dieser Studie charakterisierte ich ein neuartiges Zilienprotein FCAP33, das durch ein proteomisches Screening von primären Zilien in mIMCD3-Zellen identifiziert wurde. Mikroskopie zeigte die Lokalisierung von FCAP33 in primären Zilien, ziliären Basalkörpern, Zentriolen, Midbodies und der mitotischen Spindel. Dies deutet über die primären Zilien hinaus auf eine Rolle in MT-basierten Strukturen hin. Weitere bildgebende Verfahren zeigten die Fähigkeit von FCAP33, an bereits gebildete MTs zu binden, was auf seine Rolle als MAP und nicht als MT-Innenbindungsprotein hinweist. Die Mikrotubuli-Assoziation wurde auch im Axonem der Zilien bestätigt, wo es möglicherweise eine stabilisierende Rolle spielt. Darüber hinaus ist FCAP33 eine eher statische Komponente, die in Live-Cell-Photobleaching Experimenten nicht mobil im Zilium transportiert wird. Funktionelle Studien ergaben, dass überexprimiertes FCAP33 in voller Länge die ziliare Elongation fördert, während die Überexpression des N-terminalen Teils von FCAP33 einen dominant negativen Effekt hatte, der zu kürzeren Zilien und niedrigeren Ziliationsraten führte. Immunfluoreszenz und Pull-Down Versuche von Volllängen- und Kurzvarianten deuten darauf hin, dass FCAP33 redox-empfindliche Oligomere bildet, durch den N-terminus, der ebenso eine Rolle bei der Oligomerisierung und MT-Bindung spielt, während der C-terminus an regulatorischen Funktionen beteiligt sein könnte. Diese Hypothese kann durch in silico und strukturelle Analysen des Proteins gestützt werden. In dieser Studie wird FCAP33 als ein neuartiges ziliäres MAP vorgestellt, mit vielfältigen Funktionen in MTbasierten Organellen, durch die mögliche Regulation der Ziliogenese und der MT-Stabilität.