MicroRNA in-situ-Analytik bei Plattenepithelkarzinomen der Lunge

Abstract

Jährlich sterben viele Menschen weltweit an den Folgen einer Krebserkrankung. Die Liste der Krebstodesfälle wird dabei mit Abstand vom Lungenkarzinom angeführt, was es zu einer gefürchteten Erkrankung werden lässt. Trotz intensiver Forschung hinsichtlich neuer diagnostischer, wie auch therapeutischer Ansätze, besitzt das Lungenkarzinom eine schlechte Prognose. Eine unspezifische und häufig fehlende Symptomatik in den frühen Stadien sowie fehlende Screening-Programme führen zur meist erst späten Erstdiagnose der Erkrankung – eine folgenschwere Tatsache bei einer Erkrankung, deren Prognose stark vom Stadium der Erkrankung abhängig ist. Als ein mittelhochmaligner Subtyp des Lungenkarzinoms gilt das Plattenepithelkarzinom, welches dem Typus des Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms zugeordnet wird. Mit circa 30% der Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome ist das Plattenepithelkarzinom der zweithäufigste Subtyp dieser Gruppe. Es weist unter allen Typen des Lungenkarzinoms die stärkste Assoziation zur Exposition von Tabakrauch auf und zeigt insgesamt eine komplexe Molekularpathologie. Trotz multipler, zum Teil bekannter molekularer Veränderungen sind bisher nur wenige Medikamente speziell für das Plattenepithelkarzinom entwickelt worden. Mit der Entdeckung der MicroRNA in den 90er-Jahren eröffnete sich ein neues Forschungsgebiet, das in seiner gesamten Komplexität noch nicht überblickt werden kann. Die kleinen, einzelsträngigen Ribonukleinsäure-Moleküle, welche den nicht-kodierenden Ribonukleinsäuren zugeordnet werden, scheinen vielfältig in multiplen Regulationsmechanismen des Organismus involviert zu sein. Das große Spektrum der beeinflussten Prozesse und die Vielgestaltigkeit der Beeinflussung erschweren das Verständnis für die MicroRNA, verdeutlichen jedoch gleichzeitig die enorme Komplexität dieses Forschungsgebietes und lassen auf große Durchbrüche für die Medizin mit zunehmendem Verständnis hoffen. In vielen Krebsentitäten, so auch beim Lungenkarzinom, konnten dysregulierte MicroRNA-Expressionen und zum Teil auch Einbindungen in bekannte molekulare Signalwege nachgewiesen werden. Das Interesse an der MicroRNA als molekulares Target wächst. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Methode zur lichtmikroskopischen Visualisierung der MicroRNA beim Plattenepithelkarzinom der Lunge zu etablieren und optimieren. Mittels der chromogenen in-situ-Hybridisierung sollte dabei der Schritt von rein molekularen Nachweisverfahren hin zur Darstellung dieser Moleküle in ihrem Gewebeverband geschafft werden. Im Anschluss wurde anhand ausgewählter, spezifischer MicroRNA-Sonden der Versuch unternommen, in Grundzügen eine histo-morphologische Darstellung des MicroRNA-Expressionsprofils im Plattenepithelkarzinom der Lunge zu generieren und dies qualitativ zu kategorisieren. Zusammenfassend konnte dabei festgestellt werden, dass die Methode der chromogenen in-situ-Hybridisierung zum Verständnis der MicroRNA einen sinnvollen Beitrag darstellt, indem das Vorhandensein und die Lokalisation der MicroRNA im Gewebe lichtmikroskopisch visualisiert werden konnte. Ein routinemäßiger Einsatz genau dieser Methodik hinsichtlich diagnostischer Zwecke scheint jedoch zum jetzigen Zeitpunkt aufgrund des Aufwands der Methodik noch nicht praktikabel. In Bezug auf den feingeweblichen Nachweis von insgesamt vier, für das Plattenepithelkarzinom der Lunge charakteristischen, MicroRNAs (MicroRNA 205-5p, 126-3p, 200b-3p, 31-3p), konnten für drei MicroRNAs zuverlässige Visualisierungen erzielt werden (MicroRNA 205-5p, 126-3p, 200b-3p). Anhand dieser Ergebnisse konnte die MicroRNA 126-3p als diejenige MicroRNA identifiziert werden, welche am stabilsten nachgewiesen werden konnte. Eine direkte Kausalität zur Erklärung der unterschiedlichen Visualisierbarkeit der verschiedenen MicroRNAs im Rahmen der in-situ-Hybridisierung konnte nicht festgestellt werden. Ebenso waren keine Abhängigkeiten der Visualisierbarkeit vom Grading, Probenalter, Geschlecht und der Tumorgröße erkennbar. Es kann jedoch festgehalten werden, dass die deutlich differenzierte Visualisierbarkeit der unterschiedlichen MicroRNAs im Rahmen der Untersuchungsreihen darauf hinweist, dass diese doch sehr individuelle Anforderungen an die Untersuchungsbedingungen stellen und ein Nachweisverfahren im Sinne einer Panel-Analyse, zumindest zum jetzigen Zeitpunkt, nicht zielführend erscheint. Damit können bisherige Forschungsergebnisse, welche die Komplexität und Individualität unterschiedlicher MicroRNAs propagieren, nur bekräftigt werden. Insgesamt tragen die Resultate dieser experimentellen und methodischen Arbeit somit dazu bei, das bisherige Wissen zur MicroRNA hinsichtlich ihrer Lokalisation und ihres Vorhandenseins in den Tumorzellen des Plattenepithelkarzinoms der Lunge zu erweitern. Zudem konnten zelltyp-spezifische Erkenntnisse für den Nachweis von MicroRNA gewonnen werden, die auch für diagnostisch limitiert vorliegendes Tumorgewebe geeignet sind.

Worldwide many people die from the consequences of cancer. Lung cancer is the leading cause of cancer mortality, which makes this disease to be feared. Despite intense scientific research regarding medical diagnosis and therapy, lung cancer has a poor prognosis. Early stage lung cancer can be asymptomatic or present with non-specific symptoms. This, in addition to the lack of adequate screening programs can result in delayed diagnosis, an important factor, considering that prognosis is largely dependent on the stage of the disease. Squamous Cell Carcinoma of the lung is a type of non-small cell lung cancer. It is the second most frequent type of non-small cell lung cancer, accounting for about 30% of this category. Of all the types of lung cancer, squamous cell carcinoma has the strongest association to tobacco smoke exposure and shows a complex molecular pathology. Despite advances in the molecular understanding of the disease, only a few drugs have been developed that specifically target squamous cell carcinoma. The development of MicroRNA in the nineties opened a new area of scientific research which cannot be summarized here duo to its complexity. The short, single-stranded ribonucleic acid molecules that belong to the non-coding ribonucleic acids seem to be involved in multiple aspects of molecular regulation in the human body. The wide range of processes regulated by MicroRNA and the multidimensionality of their effect makes an understanding of their function challenging. It explains the complexity of this area of research and raises expectations for future medical applications. Many cancer types, including lung cancer, show aberrant alterations MicroRNA-expression. As the proof of integration in known molecular pathways has become established, the interest in MicroRNA as a molecular target has increased. The purpose of this research was to establish and optimize a new method for the visualization of MicroRNA in squamous cell carcinoma of the lung for optical microscopes. The use of chromogenic in-situ hybridization would allow the morphologic detection of this molecule in tissue. Furthermore, the present study aimed to generate and qualitatively evaluate this morphologic depiction of MicroRNA expression with specific selected MicroRNA-probes. In summary, this paper established that chromogenic in-situ hybridization makes a meaningful contribution to the understanding of MicroRNA by showing the availability and localization of MicroRNA in cancer tissue for optical microscopes. The routine use of this method before this point, for example in medical diagnostics, was not practical due to costs and uncertain results. Analyzing the test of four MicroRNAs, which are specific for squamous cell carcinoma of the lung (MicroRNA 205-5p, 126-3p, 200b-3p, 31-3p), there were three series of experiments that showed positive results, whereas the series with MicroRNA-31-3p showed no positive results. MicroRNA 126-3p was identified as the MicroRNA showing the most stable behavior and best sensitivity and specificity. This suggests that MicroRNA 126-3p holds the most relevance for investigations of squamous cell carcinoma of the lung. A clear explanation for the different results obtained for the various MicroRNA-probes could not be found. Furthermore, the results did not depend on grading, age of the samples, patient gender or tumor size. It was determined that the conditions affected the results. A panel-analytic seems not to be effective at this point. This work confirmed the complexity and individuality of different MicroRNAs. In summary, the results of this research contribute to and expand the understanding of MicroRNA and their availability and localization in the tissue of squamous cell carcinomas of the lung and clarify the relevance of different MicroRNAs for this subtype of lung cancer. In addition, new insights for the practical use of MicroRNA could were identified.