Der nichtselektive Kationenkanal TRPC3 im menschlichen und murinen Nierengewebe: eine immunhistochemische Untersuchung

Abstract

Hintergrund: Die Rolle des nichtselektiven Kationenkanals TRPC3 wurde unter funktionellen und pathophysiologischen Aspekten bereits durch unterschiedliche Forschungsgruppen hervorgehoben. Studien weisen darauf hin, dass eine TRPC3-Fehlexpression an der Entstehung von Hyperkalziurien, Nephrokalzinosen und in der Folge an der Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen beteiligt sein kann. Die bereits bestehende anatomische Beschreibung der TRPC3-Verteilung in der Niere beruht jedoch meist auf tierischen Modellen oder Zellkulturen, wobei sich die hierzu vorliegenden Studien teilweise widersprechen. In dieser Arbeit wird die Lokalisierung von TRPC3 in menschli- chen und tierischen Nieren mithilfe von immunhistochemischen Methoden beleuchtet. Es wird untersucht, inwiefern sich Ergebnisse aus bestehenden Studien, die an Tiermodellen gewonnen wurden, auf menschliche Proben übertragen lassen. Darüber hinaus werden Färbungen von Nephrokalzinose- betroffenem Gewebe durchgeführt, um den möglichen Einfluss dieser Pathologie auf die anti- TRPC3-Färbung zu untersuchen. Methoden: Die immunhistochemischen Färbungen wurden mithilfe von spezifischen Knockout-ge- testeten Antikörpern durchgeführt. Anhand von Peptidkontrollen konnte eine gute Antigen-Spezifität nachgewiesen werden. Es wurden Färbungen von Nierenproben von fixierten Körperspendern (n = 16), von Nephrektomien (n = 10), sowie von Mäusen angefertigt (n = 7). Weiterhin wurden Färbun- gen von pathologischen Nephrokalzinose-betroffenen Nierenproben durchgeführt (n = 5). Die Aus- wertung erfolgte semiquantitativ teils manuell durch visuelle Analyse an einem Lichtmikroskop, teils maschinell mithilfe einer computergestützten Analyse. Ein gewichteter Diaminobenzidin-Score, ähnlich dem H-Score von Pixel wurde benutzt, um die Intensität der Färbungen zu beschreiben. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigten niedrige Färbeintensitäten für TRPC3 in den Glomeruli, unab- hängig von der Spezies. Proximale Tubuli aus der Rinde und dem Mark waren meistens stark gefärbt. Distale Tubuli zeigten – je nach Lokalisation – diskrete Variationen in der Färbung, wiesen aber insgesamt eine intensive Färbung auf. Die Sammelrohre, im Gegensatz zu den Intermediärtubuli wiesen ebenfalls eine starke Färbung auf. Die untersuchten Nephrokalzinose-Präparate zeigten im Vergleich zum gesunden Gewebe eine statistisch signifikant schwächere Färbung in den proximalen Tubuli aber nicht in den Sammelrohren. Schlussfolgerung: Zusammenfassend wird hier eine systematische Analyse der Verteilung der TRPC3-Kanäle in der menschlichen Niere präsentiert, die bisher unbekannte Aspekte hervorhebt. Unterschiede in der Qualität des Gewebes waren zwischen Körperspender- und OP-Nieren zu be- obachten. Meine Ergebnisse unterstützen weitestgehend die für Tiere bereits vorhandenen For- schungsergebnisse sowie die Translation derer auf den Menschen. Die Ergebnisse, die im Zusammenhang mit den pathologischen Nephrokalzinose-Proben erzielt wurden, stärken ebenso bereits vorhandene Forschungsergebnisse von anderen Arbeitsgruppen, die eine nephroprotektive Rolle von TRPC3 im proximalen Tubulus andeuten. Jedoch sind weitere Untersuchungen mit größeren Patientenzahlen notwendig. Weiterhin werden in Zukunft diese ersten Ergebnisse mithilfe anderer Techniken bestätigt werden müssen. Andererseits werden auch funktionale Aspekte tiefer zu erforschen sein, um das Verständnis und die Behandlung des Krankheitsbildes der Nephrokalzinose zu verbessern.

Background: The role of the non-selective cation channel TRPC3 has already been highlighted under functional and pathophysiological aspects by various research groups. Studies indicate that impaired TRPC3 expression might be involved in the development of hypercalciuria, nephrocalcinosis, and subsequently in the development of chronic kidney disease. However, the existing anatomical description of the TRPC3 distribution in the kidney is mostly based on animal models or cell cultures, whereby the available studies are partially contradictory. In this work, the localization of the TRPC3 protein is examined in human and animal kidneys using immunohistochemical methods. The extent to which results from existing studies obtained in animal models can be transferred to human samples is ultimately investigated. In addition, staining of nephrocalcinosis-affected tissue is performed to investigate the potential impact of this pathology on anti-TRPC3 immunolabeling. Methods: Immunohistochemical staining was performed using specific knockout-tested antibodies. Peptide controls demonstrated their antigen specificity. Staining was performed on kidney samples obtained from fixed body donors (n = 16), from nephrectomies (n = 10), and from mice (n = 7). In addition, staining of pathological kidneys affected by nephrocalcinosis was performed (n = 5). The evaluation was carried out semi-quantitatively, partly manually, by visual analysis on a light microscope and partly automatically using a software-based analysis. A weighted diaminobenzidine score, similar to Pixel's H-score, was used to describe the intensity of the staining. Results: The results showed low staining intensities for TRPC3 in the glomeruli, regardless of species. Proximal tubules from the cortex and medulla were mostly intensively stained. Distal tubules showed – depending on localization – discrete variations in staining, but overall showed intense staining. The collecting ducts, in contrast to the intermediate tubules, displayed a strong coloration. The examined nephrocalcinosis specimens showed statistically significantly weaker staining in the proximal tubules but not in the collecting ducts compared to healthy tissue. Conclusion: In summary, a systematic analysis of the distribution of TRPC3-channels in the human kidney is presented here, highlighting previously unknown aspects. Differences in tissue quality were observed between body donor and surgical kidneys. My results largely support the results already available for animals and the translation of these to humans. The results obtained in connection with the pathological nephrocalcinosis samples also strengthen existing results from other research groups suggesting a nephroprotective role of TRPC3 in the proximal tubule. However, further studies with larger numbers of patients are necessary. In the future, the results will have to be further confirmed using other techniques. On the other hand, functional aspects need to be investigated in greater depth to improve the understanding and the treatment of nephrocalcinosis