Immunhistochemischer Nachweis des nicht-selektiven Kationenkanals TRPC6 in lymphatischen Geweben des Menschen

Abstract

Hintergrund: TRPC6 ist ein von Diacylglycerin aktivierter unselektiver Kationenkanal, der hauptsächlich für Calciumionen durchlässig ist. Er ist der Teil der TRP-Superfamilie, wird in den meisten Geweben exprimiert und kann im Rahmen physiologischer aber auch pathophysiologischer Calciumsignale mit Erkrankungen wie der fokal-segmentalen Glomerulosklerose, idiopathischer pulmonal arterieller Hypertonie oder kardialer Hypertrophie in Verbindung gebracht werden. Auch an malignen Prozessen wie der Proliferation von Brust oder Magenkrebszellen ist der Kanal beteiligt. Die Differenzierung von Bindegewebe steht ebenfalls mit TRPC6 in Verbindung. Der Kationenkanal scheint jedoch auch immunologische Funktionen innezuhaben, da er die Permeabilität von Endothelien reguliert, mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht wird und die Proliferation von B-Zell Lymphomzellen fördert. In menschlichen lymphatischen Geweben ist der Kanal bisher nur auf mRNA-Niveau oder in vereinzelten lymphatischen Zellreihen mittels Western Blot erforscht, ein direkter Nachweis konnte bisher nicht erfolgen, deshalb soll in dieser Arbeit das menschliche lymphatische Gewebe mittels Immunhistochemie untersucht werden. Methoden: Die Untersuchung der lymphatischen Gewebe auf den TRPC6 Kanal erfolgte an Körperspendern des anatomischen Instituts Homburg. Betrachtet wurden die lymphatischen Organe Lymphknoten, Milz, Tonsilla palatina, gut-associated lymphoid tissues (Ileum und Appendix vermiformis) sowie Thymus. Insgesamt wurden 102 Proben gewonnen, die der HE-Färbung zugeführt werden konnten. Die HE-Färbung diente der Identifizierung der besten fünf Proben (sortiert nach morphologischer Beurteilbarkeit und Autolyse) des jeweiligen Organs, die dann der immunhistochemischen Färbung zugeführt wurden. Eine Ausnahme stellten die Proben der Tonsilla palatina dar, die von der Klinik für Hals- Nasen- und Ohrenheilkunde des Universitätsklinikum des Saarlandes bereitgestellt wurden. Hier erfolgte die immunhistochemische Untersuchung aller drei zur Verfügung gestellten Präparate. Die Immunfärbung erfolgte mit einem Knockout-validierten Anti-TRPC6 Antikörper, einem mit Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper sowie Diaminobenzidin als Chromogen. Alle Arbeitsschritte von Organentnahme über Paraffineinbettung, Schneiden mit dem Mikrotom, HE- und immunhistochemische Färbung bis zur Eindeckung und lichtmikroskopischer Auswertung wurden von mir selbst durchgeführt mit der Ausnahme der Tonsillen Proben, die bereits im paraffinierten Zustand übergeben wurden. Ergebnisse: Die durchgeführten Immunfärbungen belegen das Vorkommen von TRPC6 in allen untersuchten lymphatischen Geweben. Lymphozyten in Lymphknoten, Milz, Tonsilla palatina, Thymus und gut-associated lymphatic tissues in Ileum und Appendix vermiformis zeigten ein positives Färbesignal, wobei das Signal im Thymus durchschnittlich am schwächsten war. Auch das follikelassoziierte Epithel der Tonsilla palatina, des Ileums und der Appendix wies einen braunen Farbumschlag des Chromogens auf. Alle angeschnittenen Gefäße lymphatischer Organe, insbesondere die Trabekelarterien der Milz, die submukösen Gefäße der Appendix und des Ileums sowie die angeschnittenen Lymphgefäße der Lymphknoten zeigten ein positives Farbsignal. Auch in den hochendothelialen Venolen, die in der Tonsille beobachtet werden konnten, manifestierte sich eine braune Färbung. Schlussfolgerung und Ausblick: Die durchgeführten Experimente weisen auf ein ubiquitäres Vorkommen des TRPC6-Kanals in lymphatischen Geweben hin, welches mit dem aktuellen Stand der TRPC6-Forschung in Einklang zu bringen ist und die physiologische, aber auch pathophysiologische Relevanz des TRPC6-vermittelten Calciumeinstroms in die Zelle und der dadurch beeinflussten Signalwege unterstreicht. Die größte Limitation der Studie stellt das hohe Alter der Körperspender dar, sodass hier weitere Untersuchungen an jungen humanen Geweben notwendig sind, um den Störfaktor der altersbedingten histomorphologischen Veränderungen auszuschalten.

Background: TRPC6 is a non-selective cation channel that is activated by diacylglycerol and is mainly permeable to calcium ions. It belongs to the TRP superfamily, is expressed in most tissues, and has been associated with diseases such as focal segmental glomerulosclerosis, idiopathic pulmonary arterial hypertension, and cardiac hypertrophy in the context of both physiological and pathophysiological calcium signaling. The TRPC6 channel is involved in various processes, including the proliferation of breast or gastric cancer cells and the differentiation of connective tissue. Additionally, it has immunological functions, regulating the permeability of endothelia and promoting the proliferation of B-cell lymphoma cells. It is also associated with autoimmune diseases. The investigation of the channel in human lymphoid tissues has so far been limited to mRNA analysis or Western blotting of isolated lymphoid cell lines. This study aims to directly detect the channel in human lymphoid tissue using immunohistochemistry. Methods: The TRPC6 channel in lymphatic tissues was analyzed using body donors from the Homburg Anatomical Institute. The lymphatic organs analyzed included lymph nodes, spleen, palatine tonsil, gut-associated lymphoid tissues (ileum and vermiform appendix), and thymus. A total of 102 samples were obtained and subjected to HE staining. The purpose of HE staining was to identify the five best samples of the respective organ, sorted according to morphological assessability and autolysis. These samples were then subjected to immunohistochemical staining. The samples of the palatine tonsil, provided by the Department of Otorhinolaryngology at Saarland University Hospital, are an exception. Here, all three specimens were subjected to immunohistochemical examination. Immunostaining was carried out using a knockout-validated anti-TRPC6 antibody and a secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. Diaminobenzidine was used as a chromogen. All steps, including sample collecting, paraffin embedding, microtome sectioning, HE and immunohistochemical staining, mounting, and light microscopic analysis were performed by the author, except for the tonsil samples, which were provided in a paraffin-embedded state. Results: The conducted immunostainings confirmed the presence of TRPC6 in all the examined lymphatic tissues. Lymphocytes in lymph nodes, spleen, palatine tonsil, thymus, and gut-associated lymphatic tissues in ileum and vermiform appendix exhibited a positive staining signal, with the signal in the thymus being the weakest on average. The follicle-associated epithelium of the palatine tonsil, ileum, and appendix also demonstrated a brown color change in the chromogen. All incised vessels of lymphatic organs, particularly the trabecular arteries of the spleen, the submucosal vessels of the appendix and ileum, as well as the incised lymphatic vessels of the lymph nodes, exhibited a positive color signal. The high endothelial venules, which could be observed in the tonsil, also demonstrated a brown coloration. Conclusion and outlook: The experiments performed indicate a ubiquitous occurrence of the TRPC6 channel in lymphoid tissues, which is consistent with the current state of TRPC6 research and underlines the physiological and pathophysiological relevance of TRPC6-mediated calcium influx into the cell and the signaling pathways influenced by it. The greatest limitation of the study is the advanced age of the body donors, so further investigations on young human tissues are necessary to eliminate the confounding factor of age-related histomorphological changes.