Versuch der Genexpressionsanalyse des nicht-selektiven Kationenkanals TRPC6 in der menschlichen Lunge

Abstract

Einleitung und Zielsetzung: Transient Receptor Potential- Kanäle stellen nicht-selektive Kationenkanäle dar, die sieben Unterfamilien umfassen. Darunter stellt TRPC6 eine Unterfamilie dar. TRPC6 bildet einen homo- oder heterotetrameren, nicht-selektiven Kationenkanal, der insbesondere eine hohe Permeabilität für Calciumionen aufweist. Er ist in zahlreichen Geweben nachweisbar, unter anderem in der Niere, dem Herz, dem Gehirn, der Plazenta, der Muskulatur und der Lunge. Seine Bedeutung zeigt sich nicht nur in physiologischen Prozessen, sondern auch im Kontext pathologischer Veränderungen. So wird TRPC6 zum Beispiel mit glomerulären und kardiovaskulären Erkrankungen, Tumorprogression sowie fibrotischen Umbauprozessen in Verbindung gebracht. In der Lunge konnte TRPC6 unter anderem mit hypoxischer Vasokonstriktion, pulmonaler Hypertonie, der chronisch- obstruktiven Lungenerkrankung, pulmonaler Fibrose und dem Ischämie- reperfusionsbedingten Lungenödem in Verbindung gebracht werden. Trotz dieser klinischen Relevanz ist die Verteilung von TRPC6 in der Lunge bislang nur unvollständig charakterisiert. Frühere Studien konnten zwar die TRPC6-mRNA im Lungengewebe und teils in spezifischen pulmonalen Strukturen nachweisen, ließen jedoch offen, aus welchen anatomischen Regionen das Material stammte. Vor diesem Hintergrund widmet sich die vorliegende Arbeit der systematischen Analyse der TRPC6-mRNA-Expression in verschiedenen Bereichen der menschlichen Lunge. Ziel ist es, die Expression und die Verteilung von TRPC6 im Ober- und Unterlappen zu untersuchen, um Erkenntnisse über mögliche topografischen Expressionsunterschiede zu gewinnen. Darüber hinaus soll untersucht werden, ob sich TRPC6-mRNA in spezifischen pulmonalen Gewebestrukturen, wie beispielsweise Bronchiolen, innerhalb dieser Lungenareale nachweisen lässt. Methodik: Es wurden insgesamt sechs Gewebeproben aus den Ober- und Unterlappen von drei Körperspendern entnommen. Um einen allgemeinen Nachweis der TRPC6-mRNA in beiden Lungenlappen zu erbringen, wurde ein Teil der Proben direkt einer Genexpressionsanalyse unterzogen. Der andere Teil der Gewebeproben wurde für die Anfertigung von Einfach- und Mehrfachkryoschnitten verwendet, um erneut eine Genexpressionsanalyse durchzuführen. Zunächst war das Ziel, die minimale Schnittanzahl zu bestimmen, bei der TRPC6-mRNA noch nachweisbar ist. Zusätzlich sollten topografische Unterschiede in der Genexpression untersucht werden. Zur histomorphologischen Darstellung der Gewebeproben wurden Kryoschnitte angefertigt, die einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung unterzogen wurden. Nachdem der Nachweis erbracht worden war, dass TRPC6-mRNA bis zu einem einzelnen Kryoschnitt nachweisbar ist, wurden weitere Kryoschnitte für die laserbasierte Mikrodissektion angefertigt. Nachfolgend sollten spezifische pulmonale Gewebestrukturen am Mikroskop identifiziert, mit dem Laser umfahren und anschließend erneut eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden. Ergebnisse und Ausblick: TRPC6-mRNA konnte in allen Gewebeproben nachgewiesen werden, selbst aus minimalem Ausgangsmaterial bis hin zu einem einzelnen Kryoschnitt. Die Ergebnisse deuten auf eine tendenziell höhere TRPC6-Expression im Oberlappen hin, was auf ein lappenspezifisches Expressionsmuster schließen lassen könnte. Diese Beobachtung könnte pathophysiologisch mit der bevorzugten Beteiligung des Oberlappens bei der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung sowie weiteren lappenspezifischen Lungenerkrankungen in Zusammenhang stehen. Die laserbasierte Mikrodissektion konnte in dieser Arbeit nicht erfolgreich umgesetzt werden, was möglicherweise auf technische Limitierungen wie übermäßige Schnittdicken, verbliebene Einbettmediumreste und das Fehlen einer kontrastverstärkenden Färbung zurückzuführen ist. Dennoch legen die erzielten Nachweise nahe, dass eine TRPC6-Analyse in mikroskopisch kleinen Lungenstrukturen möglich ist. Weiterführende, systematische Untersuchungen mit optimierter Gewebeaufbereitung und größerem Probenumfang sind erforderlich, um das lappenspezifische Verteilungsmuster zu validieren, dessen funktionelle Bedeutung zu evaluieren und TRPC6 als möglichen diagnostischen Marker oder als therapeutischen Ziel weiter zu untersuchen.

Introduction and objectives: Transient Receptor Potential Channels are non-selective cation channels that comprise seven subfamilies. TRPC6 is one of these subfamilies. TRPC6 forms a homo- or heterotetrameric, non- selective cation channel with a high permeability for calcium ions. It can be detected in numerous tissues, including the kidney, heart, brain, placenta, muscles and lungs. Its importance is not only evident in physiological processes, but also in the context of pathological changes. For example, TRPC6 is associated with glomerular and cardiovascular diseases, tumour progression and fibrotic remodelling processes. In the lungs, TRPC6 has been associated with hypoxic vasoconstriction, pulmonary hypertension, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis and ischaemia-reperfusion- induced pulmonary oedema. Despite this clinical relevance, the distribution of TRPC6 in the lungs has so far only been incompletely characterised. Earlier studies were able to detect TRPC6 mRNA in lung tissue and in some cases in specific pulmonary structures, but left open the anatomical regions from which the material originated. Against this background, the present study is dedicated to the systematic analysis of TRPC6 mRNA expression in different areas of the human lung. The aim is to analyse the expression and distribution of TRPC6 in the upper and lower lobes in order to gain insights into possible topographical differences in expression. In addition, it will be investigated whether TRPC6 mRNA can be detected in specific pulmonary tissue structures, such as bronchioles, within these lung areas. Methodology: A total of six tissue samples were taken from the upper and lower lobes of three body donors. In order to provide a general detection of TRPC6 mRNA in both lobes, a portion of the samples were directly subjected to gene expression analysis. The other part of the tissue samples was used for the preparation of single and multiple cryosections to perform gene expression analysis again. The initial aim was to determine the minimum number of sections at which TRPC6 mRNA is still detectable. In addition, topographical differences in gene expression were to be analysed. For histomorphological visualisation of the tissue samples, cryosections were prepared and subjected to haematoxylin-eosin staining. Once it had been demonstrated that TRPC6 mRNA was detectable up to a single cryosection, further cryosections were prepared for laser-based microdissection. Subsequently, specific pulmonary tissue structures were to be identified under the microscope, circled with the laser and then gene expression analysis was to be performed again. Results and outlook: TRPC6 mRNA could be detected in all tissue samples, even from minimal starting material up to a single cryosection. The results indicate a tendency towards higher TRPC6 expression in the upper lobe, which could suggest a lobe-specific expression pattern. This observation could be pathophysiologically related to the preferential involvement of the upper lobe in chronic obstructive pulmonary disease and other lobe-specific lung diseases. Laser-based microdissection could not be successfully implemented in this work, possibly due to technical limitations such as excessive section thicknesses, residual embedding medium and the lack of contrast-enhancing staining. Nevertheless, the evidence obtained suggests that TRPC6 analysis is possible in microscopically small lung structures. Further systematic studies with optimised tissue preparation and larger sample size are required to validate the lobe-specific distribution pattern, evaluate its functional significance and further investigate TRPC6 as a potential diagnostic marker or therapeutic target.