Die Blockade des Erythropoietin-producing hepatoma receptor B4 (EphB4) - Signalwegs hemmt die Vaskularisierung und das Wachstum von Endometrioseherden

Abstract

Die Endometriose ist mit einer Prävalenz von ca. 10% eine häufig vorkommende, benigne Erkrankung in der Gynäkologie, unter der insbesondere Frauen im gebärfähigen Alter leiden. Histopathologisch ist die Erkrankung durch das Auftreten von funktionalem, Endometrium-ähnlichem Gewebe außerhalb der Gebärmutterhöhle definiert. Nach der Implantationstheorie von Sampson werden während der Menstruation Endometriumfragmente retrograd über die Eileiter in die Bauchhöhle verschleppt, wo sie dann adhärieren und proliferieren. Dieser Pro-zess ist in hohem Maße von der Ausbildung neuer Blutgefäße abhängig, welche die heran-wachsenden Endometrioseherde mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgen. Die Etablierung eines funktionsfähigen Gefäßnetzwerks in den Endometrioseherden wird durch verschiedene pro- und anti-angiogene Signalwege gesteuert. Einer dieser Signalwege wird durch die membranständige Tyrosinkinase Erythropoietin-producing hepatoma receptor B4 (EphB4) und ihren Liganden Erythropoietin-producing hepatoma interactor B2 (EprinB2) vermittelt. Interessanterweise wurde eine erhöhte Expression von EphB4 auch in ektopem Endometri-umgewebe nachgewiesen.

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig untersucht, ob die Hemmung des EphB4-Signalwegs durch den Kinase-Inhibitor 4-Methyl-3-[[1-methyl-6-(3-pyridinyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-yl]amino]-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]-benzamide (NVP-BHG712) zu einer Unterdrückung der angiogenen Aktivität von Endothelzellen in vitro und der Vaskularisierung sowie des Größenwachstums von Endometrioseherden in vivo führt.

Anhand von verschiedenen Angiogenese-Assays konnte gezeigt werden, dass die Migration, die Tube Formation und die Sprouting-Aktivität sowohl von humanen Endothelzellen als auch von kultivierten Maus-Aortenringen durch NVP-BHG712 gehemmt wird.

Zur Untersuchung der Effekte von NVP-BHG712 auf die Entwicklung von neuen mikrovaskulären Netzwerken in Endometrioseherden unter in vivo Bedingungen wurden zwei etablierte Mausmodelle eingesetzt. Im ersten Modell wurden Endometriumfragmente auf die quergestreifte Muskulatur in der Rückenhautkammer von weiblichen BALB/c Mäusen transplantiert. Dieses Modell wurde zur Analyse der Gefäßmorphologie und Mikrohämodynamik der heranwachsenden Endometrioseherde mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie gewählt. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den in vitro Analysen konnte eine signifikant reduzierte funktionelle Kapillardichte mit individuell dilatierten Mikrogefäßen unter der NVP-BHG712-Behandlung im Vergleich zur Vehikel-behandelten Kontrollgruppe über einen 14-tägigen Beobachtungszeitraum nachgewiesen werden. Dieser anti-angiogene Effekt wurde am Ende der in vivo Versuche immunhistochemisch mit einer Fluoreszenzfärbung gegen CD31 zur Markierung der Mikrogefäße in den Endometrioseherden bestätigt.

Durch die syngene Transplantation von Uterusgewebe in die Bauchhöhle von BALB/c Mäu-sen konnte im zweiten Modell die Wirkung von NVP-BHG712 auf das Wachstum von Endo-metrioseherden mittels repetitiver, hochauflösender Ultraschallbildgebung über 28 Tage un-tersucht werden. Die Behandlung mit NVP-BHG712 führte zu einer Reduktion des Stromagewebes und zu einer verringerten Gesamtgröße der Endometrioseherde im Ver-gleich zur Kontrollgruppe. Zusätzliche immunhistochemische Analysen an Tag 28 zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der mikrovaskulären Dichte und der Stromapro-liferationsrate zwischen NVP-BHG712- und Vehikel-behandelten Endometrioseherden. Dies ist dadurch zu erklären, dass zu diesem späten Zeitpunkt der Herdentwicklung hauptsächlich ein Umbau der vorhandenen Gefäße und keine Angiogenese mehr stattfindet. Daher wurden in einem weiteren Experiment intraperitoneal induzierte Endometrioseherde bereits nach 7 Tagen histologisch analysiert. Zu diesem frühen Zeitpunkt konnte eine signifikant reduzierte mikrovaskuläre Dichte und Proliferationsrate des Stromagewebes unter der Behandlung mit NVP-BHG712 nachgewiesen werden.

In weiteren Analysen wurde mit Hilfe einer quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) eine tendenziell geringere messenger ribonucleic acid (mRNA)-Expression von EphB4 in NVP-BHG712 behandelten, intraperitonealen Endometrioseherden nach 28 Tagen gemessen. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass NVP-BHG712 nicht nur einen inhi-bitorischen Effekt auf die Kinase-Aktivität von EphB4 haben könnte, sondern auch auf die Genexpression.

Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die Blockade des EphB4-Signalwegs die Vaskularisierung und das Wachstum von Endometrio-seherden hemmt. Daher könnte EphB4 ein vielversprechendes pharmakologisches Target für die zukünftige Behandlung von Endometriose-Patientinnen darstellen.

Endometriosis is a frequent gynecological disorder affecting approximately 10% of women especially during the reproductive age. Histopathologically the disease is defined by the presence of functional endometrium-like tissue outside the uterine cavity. According to Sampson´s implantation theory, endometrial fragments are shed retrogradely through the fallopian tubes to the peritoneal cavity during menstruation, where they adhere and proliferate. This process is highly dependent on the formation of new blood vessels, which supply the growing endometriotic lesions with oxygen and nutrients. The establishment of a functional vascular network in endometriotic lesions is regulated by various pro- and anti-angiogenic signaling pathways. One of these signaling pathways is mediated by the membrane-based tyrosine kinase erythropoietin-producing hepatoma receptor B4 (EphB4) and its ligand erythropoietin-producing hepatoma interactor B2 (EprinB2). Interestingly, an increased expression of EphB4 has also been detected in ectopic endometrial tissue.

In the present thesis, it was analyzed for the first time whether the inhibition of the EphB4-pathway by the kinase inhibitor 4-methyl-3-[[1-methyl-6-(3-pyridinyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-yl]amino]-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]-benzamide (NVP-BHG712) suppresses the angiogenic action of endothelial cells in vitro and the vascularization as well as the growth of endometriotic lesions in vivo.

By means of various angiogenesis assays, it could be demonstrated that the migration, tube formation and sprouting activity of both human endothelial cells and of cultivated mouse aor-tic rings is inhibited by NVP-BHG712.

To analyze the effects of NVP-BHG712 on newly developing microvascular networks in en-dometriotic lesions in vivo, two different, well-established murine models were chosen. In a first experimental setting, endometrial fragments were transplanted onto the striated muscle within the dorsal skinfold chamber of female BALB/c mice. This model was selected for the analysis of the vascular morphology and microhemodynamics within the growing endometri-otic lesions by means of intravital fluorescence microscopy. In line with the results of the in vitro analysis, a significantly reduced functional capillary density with individually dilated mi-crovessels was found under NVP-BHG712 treatment when compared to vehicle-treated con-trols during an observation period of 14 days. This anti-angiogenic effect was confirmed im-munohistochemically at the end of the in vivo experiments by fluorescence staining against CD31 to label the microvessels within the endometriotic lesions.

In a second set of experiments, the syngeneic transplantation of uterine tissue into the peri-toneal cavity of BALB/c mice allowed studying the effect of NVP-BHG712 on the growth of endometriotic lesions over 28 days by means of repeated high-resolution ultrasound imaging. Treatment with NVP-BHG712 caused a regression of the stromal tissue and a decrease of the overall lesion size when compared to controls. However, in immunohistochemical anal-yses on day 28 no significant differences in the microvascular density and the stromal prolif-eration rate were detected between NVP-BHG712- and vehicle-treated endometriotic lesions. This can be explained by the fact that in this late phase of lesion development a remodeling of the existent vessels occurs rather than angiogenesis. Therefore, intraperitoneally induced endometriotic lesions were analyzed after only 7 days in an additional approach. At this early time point, a significantly reduced microvessel density and stromal proliferation rate could be detected under the treatment with NVP-BHG712.

Additional analyses by means of real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) demonstrated a tendency towards lower messenger ribonucleic acid (mRNA) expression levels of EphB4 in NVP-BHG712-treated intraperitoneal endometriotic lesions after 28 days. Hence, it may be speculated that NVP-BHG712 not only suppresses the kinase activity of EphB4 but also its gene expression.

In summary, in this thesis it could be demonstrated for the first time that interrupting EphB4 signaling suppresses the vascularization and growth of endometriotic lesions. Hence, EphB4 may represent a promising pharmacological target for the future treatment of endometriosis patients.