Gene Expression and the Effect of Ritanserin and Duloxetine on Primary Congenital Aniridia Limbal Stromal Cells, In Vitro

Abstract

Summary Congenital aniridia is a panocular disorder characterized by iris hypoplasia and aniridia-associated keratopathy (AAK), with a prevalence ranging from 1:40,000 to 1:100,000. AAK leads to progressive corneal opacity and subsequent vision loss. The limbal stem cell niche, comprised of various cell types and structures, plays a crucial role in maintaining the microenvironment and function of limbal epithelial stem cells. Basal limbal epithelial cells, limbal stromal cells, nerve endings, blood vessels, extracellular matrix (ECM), and microenvironmental signals contribute to niche integrity and function. Keratocytes primarily produce ECM components such as collagens. In AAK corneas, altered ECM components and expression of fibrotic markers (e.g., α-SMA) may contribute to the development and progression of AAK.

In the first study, we analyzed the potential effects of donor age, postmortem time, medium time, size of the corneoscleral ring used, endothelial cell density (ECD), gender, number of culture medium changes during organ culture, and donor origin on the outgrowth of limbal epithelial cells (LECs). Using a stepwise linear regression algorithm, we found that successful LEC outgrowth increases with lower donor age, fewer organ culture medium changes during storage, shorter medium time in organ culture, and smaller corneoscleral ring size.

In the second study, we evaluated the expression of PAX6 and keratocyte-specific markers, including Collagen I (COL1A1), Collagen III (COL3A1), Collagen V (COL5A1), α-smooth muscle actin (ACTA2), aldehyde dehydrogenase 3 family member A1 (ALDH3A1), keratocan (KER), lumican (LUM), and CD34, in limbal stromal cells of AAK subjects. We also examined the effects of normal-glucose serum-containing cell culture medium (NGSC-medium) and low-glucose serum-free cell culture medium (LGSF-medium) on marker expression in control limbal stromal cells (LSCs) and aniridia limbal stromal cells (AN-LSCs). There was altered expression of PAX6 and keratocyte-specific markers in AN-LSCs compared to those in healthy controls. Investigations revealed distinct impacts on both LSCs and AN-LSCs by both NGSC- and LGSF-medium. The identified differences in PAX6 and keratocyte-specific marker expression within AN-LSCs could potentially serve as crucial factors influencing the onset and advancement of AAK.

In the third study, we investigated the effects of the anti-psychotropic drugs ritanserin and duloxetine on gene expression in LSCs and AN-LSCs using NGSC- and LGSF-medium in vitro. The results revealed the following key points: 1.LGSF-medium and NGSC-medium have differing effects on gene expression in AN-LSCs and LSCs following ritanserin and duloxetine treatment. 2.Treatment with the anti-psychotropic drugs ritanserin and duloxetine alters PAX6 and TGF-β1 gene expression in AN-LSCs cultured in LGSF-medium. 3.Ritanserin and duloxetine treatment affects retinoic acid signaling and the expression of keratocyte characteristic markers in AN-LSCs and LSCs. These treatments may impact corneal stromal wound healing in both healthy and congenital aniridia corneas.

To gain a comprehensive understanding of the effects of anti-psychotropic drugs on congenital aniridia corneas, further investigation is imperative. For example, examining the impact of different glucose concentrations in two conditioned mediums on LSCs and AN-LSCs, as well as evaluating the performance of anti-psychotropic drugs in a PAX6 haploinsufficiency animal cornea model, should be explored in future studies. Additionally, a multicenter, randomized clinical trial could further clarify the advantages and disadvantages of using anti-psychotropic drugs in the treatment of AAK.

Zusammenfassung

Kongenitales Aniridie ist eine panokuläre Erkrankung, die durch Iris-Hypoplasie und aniridieassoziierte Keratopathie (AAK) gekennzeichnet ist, mit einer Prävalenz von 1:40.000 bis 1:100.000. AAK führt zu fortschreitender Hornhauttrübung und anschließendem Sehverlust. Die Stammzellnische der Limbusregion, bestehend aus verschiedenen Zelltypen und Strukturen, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Mikroumfelds und der Funktion der Stammzellen des limbalen Epithels. Basale limbale Epithelzellen, limbale Stromazellen, Nervenenden, Blutgefäße, extrazelluläre Matrix (ECM) und mikroumwelte Signale tragen zur Integrität und Funktion der Nische bei. Keratozyten produzieren hauptsächlich ECM-Komponenten wie Kollagene. In AAK-Korneas sind veränderte ECM-Komponenten und die Expression fibrotischer Marker (z. B. α-SMA) an der Entwicklung und Progression von AAK beteiligt.

In der ersten Studie haben wir die potenziellen Auswirkungen des Spenderalters, der postmortalen Zeit, der Mediumzeit, der Größe des verwendeten Corneoskleralrings, der Endothelzellendichte (ECD), des Geschlechts, der Anzahl der Kulturmediumwechsel während der Organinkultur und des Spenderursprungs auf das Wachstum limbaler Epithelzellen (LECs) analysiert. Mit einem schrittweisen linearen Regressionsalgorithmus haben wir festgestellt, dass erfolgreiches LEC-Wachstum mit niedrigerem Spenderalter, weniger Kulturmediumwechseln während der Lagerung, kürzerer Mediumzeit in der Organinkultur und kleinerer Größe des Corneoskleralrings zunimmt.

In der zweiten Studie haben wir die Expression von PAX6 und keratzytenspezifischen Markern, einschließlich Kollagen I (COL1A1), Kollagen III (COL3A1), Kollagen V (COL5A1), α-glatter Muskelaktin (ACTA2), Aldehyddehydrogenase 3-Familienmitglied A1 (ALDH3A1), Keratokan (KER), Lumikan (LUM) und CD34, in limbalen Stromazellen von AAK-Subjekten bewertet. Wir haben auch die Auswirkungen von normalem Glukose-Serum-haltigem Zellkulturmedium (NGSC-Medium) und serumfreiem Zellkulturmedium mit niedrigem Glukosegehalt (LGSF-Medium) auf die Markerexpression in Kontroll-Limbalstromazellen (LSCs) und Aniridie-Limbalstromazellen (AN-LSCs) untersucht. Es gab eine veränderte Expression von PAX6 und keratzytenspezifischen Markern in AN-LSCs im Vergleich zu denen in gesunden Kontrollen. Untersuchungen zeigten unterschiedliche Auswirkungen sowohl auf LSCs als auch auf AN-LSCs durch NGSC- und LGSF-Medium. Die festgestellten Unterschiede in der Expression von PAX6 und keratzytenspezifischen Markern innerhalb von AN-LSCs könnten potenziell als entscheidende Faktoren dienen, die den Beginn und Fortschritt von AAK beeinflussen.

In der dritten Studie haben wir die Auswirkungen der Antipsychotika Ritanserin und Duloxetin auf die Genexpression in LSCs und AN-LSCs unter Verwendung von NGSC- und LGSF-Medium in vitro untersucht. Die Ergebnisse ergaben folgende Schlüsselpunkte:

LGSF-Medium und NGSC-Medium haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Genexpression in AN-LSCs und LSCs nach Behandlung mit Ritanserin und Duloxetin. Die Behandlung mit den Antipsychotika Ritanserin und Duloxetin verändert die PAX6- und TGF-β1-Genexpression in AN-LSCs, die in LGSF-Medium kultiviert wurden. Die Behandlung mit Ritanserin und Duloxetin beeinflusst die retinoische Säure-Signalgebung und die Expression keratozytenspezifischer Marker in AN-LSCs und LSCs. Diese Behandlungen können die Heilung von Hornhautstroma bei gesunden und angeborenen Aniridie-Korneas beeinflussen.

Um ein umfassendes Verständnis der Auswirkungen von Antipsychotika auf angeborene Aniridie-Korneas zu erlangen, ist eine weitere Untersuchung unerlässlich. Beispielsweise sollten die Auswirkungen unterschiedlicher Glukosekonzentrationen in zwei konditionierten Medien auf LSCs und AN-LSCs untersucht werden, sowie die Leistung von Antipsychotika in einem Tiermodell der PAX6-Haploinsuffizienz-Kornea evaluiert werden. Zusätzlich könnte eine multizentrische, randomisierte klinische Studie weitere Aufschlüsse über Vor- und Nachteile der Verwendung von Antipsychotika bei der Behandlung von AAK liefern.