Immunhistochemischer Nachweis des nicht-selektiven Kationenkanals TRPC3 in Leber und Gallenblase des Menschen

Abstract

Hintergrund: Schon seit mehreren Jahrzehnten sind die TRP-Kationenkanäle (transient receptor potential), mit ihrer Unterfamilie der TRPC-Proteine, Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Eine Mutation des TRP-Proteins der Fruchtfliege Drosophila melanogaster führte ursprünglich zur Entdeckung der Kanäle, die vor allem für Calcium-Ionen permeabel sind. Für einige dieser Proteine konnte in weiterführenden Arbeiten bereits Korrelation zu pathologischen Prozessen und Erkrankungen hergestellt werden. Zusammenhänge zu kardiovaskulären Erkrankungen und karzinogenen Prozessen wurden schon für Mitglieder der TRPC-Subfamilie beschrieben. Insbesondere das in dieser Arbeit untersuchte Protein TRPC3 scheint in Verbindung mit dem Ovarial-Karzinom und der spinozerebellären Ataxie, die zu den neurodegenrativen Krankheiten gezählt wird, zu stehen. Um Korrelation und/oder Kausalität zwischen der Expression eines Ionenkanals oder der Mutation eines solchen mit pathologischen Prozessen in Verbindung zu bringen, bedarf es natürlich zunächst der Antwort auf die grundlegende Forschungsfrage, in welchem Gewebe dieser Ionenkanal exprimiert wird. Der Nachweis des TRPC3-Proteins konnte bisher über Analysen der Genexpression bei Menschen und Nagetieren für viele Organe erbracht werden. Die Datenlage zu immunhistochemischen Nachweisen von TRPC3 in menschlichem Gewebe ist zum jetzigen Zeitpunkt allerdings spärlich. Die Leber, die eines der beiden Organe ist, die für diese Arbeit untersucht wurden, spielt als eine der Hauptverdauungsdrüsen eine entscheidende Rolle in unserem Stoffwechsel. Sie synthetisiert essentielle Substanzen und metabolisiert körpereigene und körperfremde Stoffe. Im Zusammenspiel mit der Gallenflüssigkeit und der Gallenblase als deren Speicherort, ist sie unerlässlich für einen funktionierenden Stoffwechsel. Für diese Funktionen sind Signaltransduktionsprozesse und Ionenkonzentrationsänderungen, an welchen auch Calcium maßgeblich beteiligt ist, zwangsläufig von Bedeutung. Ziel dieser Arbeit war es daher, den nicht-selektiven Kationenkanal TRPC3 mittels immunhistochemischer Methodik in Leber und Gallenblase nachzuweisen. Methoden: Für diese Arbeit wurden bei acht Körperspender*innen (n=8) des anatomischen Institutes Homburg Proben von Leber und Gallenblase entnommen. Die Körperspender*innen wurden mit Nitritpökelsalz-Ethanol-Polyethylenglycol (NEP) fixiert. Pro Körperspender*in sollten neun Gewebeproben (n=9) entnommen werden, sechs davon in der Leber (n=6) und drei davon in der Gallenblase (n=3). Bei drei der Körperspender*innen konnte keine Probenentnahme in der Gallenblase erfolgen, da diese höchstwahrscheinlich durch einen früheren operativen Eingriff entfernt wurde. Die Probenentnahmestellen orientierten sich an der makroskopischen Anatomie der Organe. Anschließend wurden die Proben histologisch aufgearbeitet. Dabei wurde das entnommene Gewebe in Paraffin eingebettet und die so entstandenen Blöcke wurden im Anschluss geschnitten. Danach erfolgte eine Färbung der Gewebeschnitte mit Hämatoxylin-Eosin, um die Qualität der geschnittenen Proben beurteilen zu können. Entsprechende Qualitätskriterien waren unter anderem ein vollständiger Gewebeschnitt ohne Risse und möglichst keine Epithelabschilferungen. Anschließend wurden Proben anhand dieser Qualitätsmerkmale für die immunhistochemische Färbung ausgewählt, mit welcher TRPC3 nachgewiesen werden sollte. Für diese Arbeit wurde das Verfahren der indirekten Immunhistochemie angewendet, wobei ein gegen TRPC3 gerichteter Knockout-validierter Primärantikörper und ein Enzym-gekoppelter Sekundärantikörper verwendet wurden. Das Enzym des Sekundärantikörpers war die horseradish peroxidase (HRP), welche im Deutschen unter dem Namen Meerrettichperoxidase bekannt ist. Bei dem chromogenen Substrat, welches durch das Enzym umgesetzt wurde, handelte es sich um 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB). Ergebnisse: Das Ergebnis der Laborarbeit war eine deutlich, positive Färbereaktion der Gewebeproben von Leber und Gallenblase. In den Analysen zeigten sich die Proben des Lebergewebes zu den Proben des Gallenblasengewebes weitestgehend gleich stark gefärbt. Somit konnte die Expression von TRPC3 in Leber und Gallenblase des Menschen nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Mit dieser Arbeit konnte der nicht-selektive Kationenkanal TRPC3 in humanem Gewebe von Leber und Gallenblase nachgewiesen werden. Damit wird das Wissen über die Expression von TRPC3 beim Menschen erweitert und kann als Ansatzpunkt für fortführende wissenschaftliche Arbeit bezüglich der umfangreichen Thematik der TRPC- und insbesondere TRPC3-Proteine dienen. Im Hinblick auf die Funktion scheint es naheliegend, dass der nicht-selektive Kationenkanal auf zellulärer Ebene durch seine Calcium-Permeabilität zum physiologischen Gleichgewicht der Ionenkonzentrationen beiträgt. Jenes Gleichgewicht ist von grundlegender Bedeutung für die Funktionsfähigkeit einer Zelle, ob im Rahmen der Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotentials, der Weiterleitung von Signalen oder genereller Metabolisierungsfunktionen einer Zelle. Der Sachverhalt, dass einige Arbeiten auf einen Zusammenhang zwischen einer Veränderung der Expression von TRPC3 und des strukturverwandten Proteins TRPC6 und karzinogener Prozesse deuten, lässt vermuten, dass auch für Leber und Gallenblase eine solche Korrelation bestehen könnte. In diesem Zusammenhang sind noch weitere Nachforschungen notwendig.

Background: TRP-cation channels (transient receptor potential), with their subfamily of TRPC proteins, have been the subject of intensive scientific research for several decades. A mutation of the TRP protein in the fruit fly Drosophila melanogaster, originally led to the discovery of the primarily calcium-permeable channels. For some of these proteins, correlations to pathological processes and diseases have already been established in further work. For example, connections to cardiovascular diseases and carcinogenic processes have been described, specifically for channels of the TRPC subfamily. Thus far, a connection with ovarian carcinoma and spinocerebellar ataxia, which is a neurodegenerative disease, has been established for TRPC3 in particular. In order to establish a correlation and/or causality between the expression or mutation of ion channels with pathological processes, an answer to the fundamental research question, in which tissue the ion channel that is discussed is expressed, is of course required first. To date, the TRPC3 channel has been detected for many organs by analyzing gene expression in humans and rodents. The data on immunohistochemical detection of TRPC3 in human tissue is currently sparse. As one of the main digestive glands, the liver plays a crucial role in our metabolism. It synthesizes essential substances and metabolizes endogenous and exogenous substances. In interaction with the bile and the gallbladder the liver is essential for a functioning metabolism. Signal transduction processes and changes in ion concentration, in which calcium is also significantly involved, are of crucial importance for these functions. The aim of this work was therefore to detect the non-selective cation channel TRPC3 in the liver and gallbladder using immunohistochemical methods. Methods: For this work, liver and gallbladder samples were obtained from eight body donors (n=8) of the Anatomical Institute Homburg. The body donors were fixated with nitrite pickling salt-ethanol-polyethylene glycol fixation (NEP). In total, nine tissue samples (n=9) were taken from each body donor, six of them in the liver (n=6) and three of them in the gallbladder (n=3). In three of the body donors, it was not possible to take a sample from the gallbladder, as it was most likely removed by a previous surgical procedure. With regard to the sampling points, orientation was based on the macroscopic anatomy of the organs. After the removal the samples were processed histologically, therefore they were embedded in paraffin and the resulting blocks were cut afterwards. Subsequently, the tissue sections were stained with hematoxylin-eosin, in order to be able to assess the quality of the sectioned samples. Corresponding quality criteria included a complete tissue section without tears and no epithelial desquamation. Based on these quality characteristics, samples were then selected for the immunohistochemical staining, with which TRPC3 was to be detected. Indirect immunohistochemistry was used for this work, using a knockout-validated primary antibody directed against the TRPC3 channel and an enzyme-linked secondary antibody. The enzyme coupled to the secondary antibody was horseradish peroxidase (HRP). The chromogenic substrate that was converted by the enzyme was 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Results: The result of this work was a clearly positive staining reaction in the tissue samples from the liver and gallbladder. In the analysis, the liver tissue samples were mostly stained with the same intensity compared to the tissue samples of the gallbladder. Thus, the expression of TRPC3 in human liver and gallbladder could be detected. Conclusion: With this work, the non-selective cation channel TRPC3 could be detected in human liver and gallbladder tissue. This expands the knowledge about the expression of TRPC3 in human tissue and can serve as a starting point for further scientific work on the extensive topic of TRPC-, and TRPC3-proteins in particular. In terms of function, it appears that, due to its calcium permeability, the non-selective cation channel contributes to the physiological balance of ion concentrations at cellular levels. The balance of the various ions involved at cellular level is fundamental to the functioning of a cell, whether in maintaining the resting membrane potential, the transmission of signals or the cell's metabolic function in general. Furthermore, some work on TRPC3 indicates a change in the expression pattern in the context of carcinogenic processes in the ovary. The extent to which the expression of the non-selective cation channel TRPC3 correlates with pathological processes in the liver and gallbladder remains open at this point and requires further investigation.