Der Einfluss von Sildenafil und Cilostazol auf die Frakturheilung in der alten Maus

Abstract

Der demografische Wandel unserer Gesellschaft bedingt, dass die Medizin der Zukunft noch stärker von älteren Patienten geprägt sein wird, als dies schon in der Gegenwart der Fall ist. Da im Alter eine geringere Heilungskapazität besteht und Frakturen mit einer höheren Mortalität assoziiert sind, ist es von besonderem Interesse, diese fachgerecht behandeln zu können. Viele Faktoren können zur Verschlechterung der Knochenregeneration im Alter beitragen, darunter eine verringerte Angiogenese, eine beeinträchtigte Entzündungsregulierung sowie weitere negative Auswirkungen des Alters auf eine Vielzahl molekularer und zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Studie werden zum ersten Mal die Auswirkungen von Sildenafil und Cilostazol auf die Frakturheilung bei älteren Mäusen unter Verwendung eines Modells für geschlossene Femurfrakturen untersucht. Sildenafil hemmt die Phosphodiesterase-5 und wird sehr häufig bei erektiler Dysfunktion eingesetzt. Zudem ist es auch zur Therapie der pulmonalarteriellen Hypertonie zugelassen. Darüber hinaus konnte in vorherigen Studien gezeigt werden, dass Sildenafil die Angiogenese und die Knochenneubildung fördert. Cilostazol ist ein Hemmstoff der Phosphodiesterase-3 und für die Therapie der pAVK im Stadium II zugelassen. Der Wirkstoff besitzt unter anderem thrombozytenaggregationshemmende Eigenschaften und hat, ähnlich wie Sildenafil, in präklinischen Studien proangiogene und proosteogene Wirkungen gezeigt. Für die Studie wurde bei alten CD-1-Mäusen (Alter: 16-18 Monate) in Narkose mithilfe einer Guillotine eine geschlossene Fraktur des Femurs verursacht und diese durch Einbringen der Mouse ScrewTM osteosynthetisch versorgt. Für den ersten Studienabschnitt wurde eine Sildenafilgruppe (n=21) und eine Kontrollgruppe (n=21) gebildet. Die Tiere erhielten postoperativ täglich in der Sildenafilgruppe 5 mg/kg KG Sildenafil und in der Kontrollgruppe 0,9%ige NaCl-Lösung über eine Magensonde oral verabreicht. Für den zweiten Studienabschnitt wurde eine Cilostazolgruppe (n=21) und eine Kontrollgruppe (n=21) gebildet. Die Tiere erhielten postoperativ täglich in der Cilostazolgruppe 30 mg/kg KG Cilostazol und in der Kontrollgruppe 0,9%ige NaCl-Lösung über eine Magensonde oral verabreicht. Nach 2 und 5 Wochen Versuchszeit wurden die Tiere getötet und ihre Femora für röntgenologische, biomechanische, mikrocomputertomographische, histologische und immunhistochemische Untersuchungen verwendet. Zudem wurden nach 2 Wochen proteinbiochemische Analysen mittels Western Blot durchgeführt. Die durchgeführten Analysen zeigen, dass bei den mit Sildenafil behandelten Mäusen das Knochenvolumen und das Verhältnis von Kallus zu Durchmesser des Femurs 5 Wochen nach der Fraktur im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant zunahmen. Dies ging mit einer verringerten Anzahl von Osteoklasten sowie einer erhöhten Expression von Osteoprotegerin (OPG) und einer verringerten Expression des Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) einher. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Sildenafil die Frakturheilung im Alter nicht verbessert, sondern den Prozess des Knochenumbaus verzögert, was höchstwahrscheinlich auf eine geringere Anzahl und Aktivität von Osteoklasten im Kallusgewebe zurückzuführen ist. Bei den mit Cilostazol behandelten Tieren zeigen die Ergebnisse im Vergleich zu den Kontrolltieren eine signifikant erhöhte Biegesteifigkeit nach 2 Wochen und eine verstärkte Knochenbildung nach 5 Wochen. Dies ging mit einer höheren Anzahl neu gebildeter CD31-positiver Mikrogefäße sowie einer erhöhten Expression von Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) im Kallusgewebe einher. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cilostazol die Frakturheilung bei alten Mäusen beschleunigt, indem es die Angiogenese und die Expression von PI3K und RUNX2 stimuliert. Daher könnte Cilostazol ein vielversprechender Wirkstoff zur Förderung der Knochenheilung nach Frakturen im Alter sein.

The demographic changes in our society lead to a steadily increasing number of geriatric patients. Lower bone healing capacity and fractures in aged are associated with higher mortality when compared to young adults. Therefore, geriatric patients represent a major challenge for our health care system. Many factors may contribute to the deterioration of bone regeneration in the elderly, including reduced angiogenesis, impaired inflammatory regulation and other negative effects of age on a variety of molecular and cellular processes. In our study, we investigated the effects of sildenafil and cilostazol on fracture healing in old mice using a model of closed femur fractures. Sildenafil is a phosphodiesterase-5 inhibitor. It is commonly used for treating erectile dysfunction and is also approved for the treatment of pulmonary arterial hypertension. In addition, previous experimental studies have shown that sildenafil promotes angiogenesis and bone formation. Cilostazol is a phosphodieesterase-3 inhibitor and is approved for the treatment of stage II peripheral artery disease. Moreover, the drug has antiplatelet properties and demonstrates pro-angiogenic and proosteogenic effects in preclinical studies. For the present study, a fracture of the femur was induced in aged CD-1 mice (age: 16-18 months) under anesthesia using a 3-point bending device. The fracture was stabilized by inserting a MouseScrewTMImplant. In the first part of the study, the sildenafil group (n=21) was compared with a control group (n=21). After fracture, the animals received 5 mg/kg body weight sildenafil in the sildenafil group and 0.9% NaCl solution in the control group orally by gavage daily. In the second part of the study, the cilostazol group (n=21) was compared with a control group (n=21) respectively. After fracture, the animals received 30 mg/kg bodyweight cilostazol in the cilostazol group and 0.9% NaCl solution in the control group orally by gavage daily. At 2 and 5 weeks after surgery, the animals were sacrificed and the femora were used for radiological, biomechanical, microcomputertomographic, histologic and immunohistochemical examinations. In addition, proteinbiochemical analyses were performed at 2 weeks after surgery by Western blotting. The analysis of the first part of the study revealed a significantly increased bone volume and higher ratio of callus to femora bone diameter at 5 weeks after fracture in sildenafil-treated mice when compared to controls. This was associated with a reduced number of osteoclasts as well as an elevated expression of osteoprotegerin (OPG) and a reduced expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). These findings indicate that sildenafil does not improve fracture healing in the elderly but delays the process of bone remodeling, most likely due to a reduced number and activity of osteoclasts within the callus tissue. The analysis of the second part of the study showed a significantly increased bending stiffness at 2 weeks and an increased bone formation at 5 weeks after surgery in cilostazol-treated animals compared with controls. This was associated with a higher number of newly formed CD31-positive microvessels and an increased expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and runt-related transcription factor 2 (RUNX2) within the callus tissue. These results suggest that cilostazol accelerates fracture healing in aged mice by stimulating angiogenesis and the expression of PI3K and RUNX2. Therefore, cilostazol may be a promising agent to promote bone healing after fractures in the elderly.