Genomweite Untersuchung altersassoziierter DNA-Methylierungsunterschiede zur Identifizierung altersassoziiert differenziell exprimierter Gene

Abstract

Der Alterungsprozess ist bei Wirbeltieren ein komplexer, physiologischer Prozess, der mit einem allgemein erhöhten Krankheitsrisiko, sowie einer erhöhten Anfälligkeit für altersbedingte Erkrankungen einhergeht. Der Prozess des Alterns wurde außerdem mit Veränderungen der DNA-Methylierung in Verbindung gebracht, welche wiederum die Genexpression beeinflussen. Mit steigendem Alter kommt es dabei zu einer Verringe-rung der genomweiten DNA-Methylierung, während es in spezifischen regulatorischen Regionen zu einer Hypermethylierung kommt. Bislang ist jedoch noch nicht vollständig geklärt, welche spezifischen Gene durch altersabhängige Veränderungen der DNA-Methylierung betroffen sind und welche Konsequenz dies für die Genexpression hat. In der hier vorliegenden Arbeit sollten deshalb altersabhängige Veränderungen in der DNA-Methylierung untersucht werden, um Gene mit signifikanten altersabhängigen Methylierungsunterschieden zu identifizieren und ihr Expressionsprofil zu untersuchen. Mit Hilfe des Infinium® MethylationEPIC BeadChip Arrays von Illumina wurde eine ge-nomweite Methylierungsanalyse durchgeführt, die zu dem Ergebnis kam, dass die Mehrzahl der 853.307 untersuchten CpG-Dinukleotide im Alter hypermethyliert ist. Dies ist vorrangig auf die Tatsache zurückzuführen, dass bei dem Infinium® MethylationEPIC BeadChip Array vor allem regulatorische, tumorrelevante CpG-Stellen untersucht wer-den. Außerdem wurden durch die genomweite Methylierungsanalyse sowie durch an-schließendes Deep Bislufite Sequencing regulatorisch relevante CpG-Stellen identifi-ziert, die zwischen jungen und alten Probanden hoch signifikant unterschiedlich methyl-iert sind. Die CpG-Stellen wurden ihren assoziierten Genen zugeordnet. Die Mehrzahl dieser Gene übt eine regulatorische Funktion im Bereich Zellwachstum, Zellteilung und Genexpression aus. Besonders die Gene FHL2, HOXA5 und RPA2 wiesen bei älteren Probanden eine signifikant erhöhte DNA-Metyhlierung sowie eine signifikant verminder-te Genexpression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene auf. Zahlreiche Binde-stellen für Transkriptionsfaktoren um die entsprechenden CpG-Stellen der drei Gene sprechen dafür, dass hier eine funktionelle repressive Wirkung der Methylierung auf die Genexpression vorliegt. Für die Gene ASH1L, ASCL2 und NWD1 zeigten sich ebenfalls signifikante Unterschiede in der mRNA-Expression, allerdings konnte die Proteinebene aufgrund fehlender Expression im verwendeten Monozytenlysat nicht untersucht wer-den. Ergänzend wurde die altersassoziierte Genexpression von TP53 und PTEN analy-siert, da HOXA5 bekanntlich als deren Regulator fungiert. Auch hier zeigte sich bei TP53 ein signifikanter Expressionsverlust im Alter, während PTEN eine ähnliche, aber nicht signifikante Tendenz aufwies. Besonders relevant ist die reduzierte Expression von HOXA5 im Kontext seiner tumorsuppressiven Rolle als Aktivator von TP53, was einen möglichen Mechanismus für die erhöhte Tumoranfälligkeit im Alter darstellen könnte. Ebenso könnte die altersbedingte Reduktion von FHL2 zur Krebsentstehung beitragen, da dessen Expression in zahlreichen Tumorarten verändert ist. RPA2 wiede-rum ist essenziell für DNA-Reparatur und Telomerstabilität – eine verminderte Expres-sion könnte somit zu genomischer Instabilität im Alter führen. Insgesamt zeigen die Er-gebnisse dieser Arbeit eine tiefgreifende epigenetische Umstrukturierung im Alter mit funktionellen Auswirkungen auf die Genexpression, die sowohl für das bessere Verständnis epigenetischer Mechanismen im Alter als auch für das Verständnis von alters-assoziierten Erkrankungen von Bedeutung sind.

The aging process in vertebrates is a complex physiological phenomenon that is associated with an overall increased risk of disease and a heightened susceptibility to age-related disorders. Aging has also been linked to alterations in DNA methylation, which in turn affect gene expression. With increased age, global DNA methylation levels tend to decrease, while hypermethylation oc-curs in specific regulatory regions. However, it is not yet fully understood which specific genes are affected by age-dependent changes in DNA methylation and what consequences these changes have for gene expression. This study therefore aimed to investigate age-related changes in DNA methylation in or-der to identify genes with significant age-related differences in DNA methyla-tion and to examine their expression profiles. A genome-wide methylation analysis was conducted using the Illumina Infinium® MethylationEPIC BeadChip Array, which revealed that the majority of the 853,307 analyzed CpG dinucleotides were hypermeth-ylated with age. This is primarily due to the fact that the Infinium® MethylationEPIC BeadChip Array mainly investigates regulatory, tumor-related CpG sites. Moreover, genome-wide methylation analysis and subsequent Deep Bisulfite Sequencing revealed regulatory CpG sites that were significantly differentially methylated between young and old participants. These CpG sites were assigned to their associated genes. The majority of these genes play a regulatory role in cell growth, cell division, and gene expression. Particularly, the genes FHL2, HOXA5 and RPA2 showed significantly increased DNA methylation and significantly reduced gene expression at both the mRNA and protein levels in older participants. Numerous transcription factor binding sites around the cor-responding CpG sites of these three genes suggest that there is a functional repressive effect of DNA methylation on gene expression. For the genes ASH1L, ASCL2 and NWD1, significant differences in mRNA expression were also observed. However, pro-tein levels could not be investigated due to the absence of expression in monocytes. Additionally, age-associated gene expression of TP53 and PTEN was analyzed, as HOXA5 is known to act as their regulator. Here, a significant loss of TP53 expression with age was observed, while PTEN showed a similar but not significant trend. Particularly relevant is the reduced expression of HOXA5 in the context of its tumor-suppressive role as an activator of TP53, which could represent a possible mechanism for the increased susceptibility to tumors with age. Similarly, the age-related reduction of FHL2 could contribute to cancer development, as its expression is altered in several tumor types. RPA2, in turn, is essential for DNA repair and telomere stability. A reduced RPA2 expression could therefore lead to genomic instability with age. Overall, the re-sults of this study show a profound epigenetic restructuring with functional consequences for gene expression, which is important both for a better understanding of epigenetic mechanisms in aging and for understanding age-associated diseases.