Funktionelle Analyse der miR-200b-3p in Bronchialkarzinomen Kurzzeitüberlebender

Abstract

Das Lungenkarzinom stellt eine der deutschland- und weltweit häufigsten Krebserkrankungen dar und weist trotz zahlreicher therapeutischer Ansätze eine ungünstige Prognose auf. Für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika ist ein besseres Verständnis der Karzinogenese des Lungenkarzinoms auf molekularbiologischer Ebene unabdingbar. Einen vielversprechenden Forschungsansatz stellen microRNAs dar, deren Expression in Tumorgeweben verändert ist und die sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Wirkungen ausüben können. In dieser Arbeit erfolgt die funktionelle Analyse der miR-200b-3p in Bronchialkarzinomen Kurzzeitüberlebender. Die miR-200b-3p ist in Bezug auf Lungenkarzinome von besonderem Interesse, da ihre Expression exklusiv im Tumorgewebe von Kurzzeitüberlebenden mit einem initial günstigen Tumorstaging im Vergleich zum Normalgewebe hochreguliert ist. Um den Einfluss der miR-200b-3p auf die Transformation der physiologischen Zelle zur Lungenkrebszelle und die Krebsprogression zu verstehen und den möglichen Zusammenhang zwischen der Überexpression der miR-200b-3p und der höheren Aggressivität der Lungenkarzinome der Kurzzeitüberlebenden zu erforschen, wurden in dieser Arbeit 31 bioinformatisch vorhergesagte Zielgene untersucht. Mittels HiTmIR-Dual-Luciferase-Assay konnten 30 dieser Zielgene als Zielgene der miR-200b-3p validiert werden. Für den anschließenden Mutageneseassay wurden die miR-200b-3p-Bindestellen in den zehn im HiTmIR-Dual-Luciferase-Assay am stärksten reprimierten Zielgene mutiert, wobei alle zehn als direkte Zielgene der miR-200b-3p validiert werden konnten. Zwei dieser zehn validierten Zielgene, LRP1 und PPM1F, wurden detaillierter untersucht. Durch die Quantifizierung der LRP1- und PPM1F-Expression in mit miR-200b-3p transfizierten A549-Zellen mittels qRT-PCR und Western Blot konnten gezeigt werden, dass die Expression der beiden Zielgene auch in einer Lungenkrebszelllinie durch Überexpression der miR-200b-3p gehemmt wird. Von besonderem Interesse sind LRP1, PPM1F, HIPK3, CELF2 und LATS2, die eine tumorsuppressive Wirkung aufweisen und deren Expression durch die miR-200b-3p inhibiert wird.

Lung carcinoma is one of the most common cancers in Germany and worldwide and has an unfavorable prognosis despite numerous therapeutic approaches. A better understanding of the carcinogenesis of lung cancer at the molecular level is essential for the development of new chemotherapeutic agents. A promising research approach is focused on microRNAs which expression is altered in tumor tissues and which can exert both tumor suppressive and oncogenic effects. In this work, functional analysis of miR-200b-3p in bronchial carcinomas of short-term survivors is conducted. The miR-200b-3p is of particular interest in regards to lung carcinomas because its expression is exclusively upregulated in tumor tissues of short-term survivors with an initial favorable tumor staging compared to normal tissues. To understand the impact of miR-200b-3p on carcinogenesis and to explore the possible relationship between miR-200b-3p overexpression and the higher aggressiveness of lung carcinomas of short-term survivors, 31 bioinformatically predicted target genes were investigated in this work. Using HiTmIR dual luciferase assay, 30 of these target genes were validated as target genes of miR-200b-3p. In the subsequent mutagenesis assay, the miR-200b-3p binding sites of the ten most strongly repressed target genes in the initial HiTmIR dual luciferase assay were mutated. In the mutagenesis HiTmIR assay all ten were validated as direct target genes of miR-200b-3p. Two of the ten validated target genes, LRP1 and PPM1F, were examined in more detail. Quantification of LRP1 and PPM1F expression in miR-200b-3p transfected A549 cells by qRT PCR and Western blot demonstrated that the expression of the two target genes was also inhibited in a lung cancer cell line by overexpression of miR-200b-3p. Of particular interest are LRP1, PPM1F, HIPK3, CELF2, and LATS2 which have tumor suppressive effects and are repressed by miR-200b-3p overexpression.