Der Einfluss von Aspartam und Aspartam-Metaboliten auf zellulären oxidativen Stress, Mitochondrien und die Lipidhomöostase von SH-SY5Y-Zellen

Abstract

In den vergangenen Jahrzehnten ließ sich ein weltweiter Anstieg von Übergewicht sowie metabolischen Erkrankungen wie Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 verzeichnen. Diese sogenannten Wohlstandserkrankungen werden insbesondere mit den veränderten Lebensbedingungen in Verbindung gebracht, welche neben zu wenig körperlicher Bewegung durch den Konsum einer hochkalorischen und kohlenhydratreichen Nahrung inklusive vieler kurzkettiger Zucker gekennzeichnet ist. Seit einigen Jahren entwickelt sich ein zunehmendes Interesse an „alternativen“, kalorienarmen Nahrungszusätzen, mit welchen der Einsatz hochkalorische Zucker reduziert werden kann – Tendenz steigend. Hierzu zählt unter anderem auch der Süßstoff Aspartam, der mit seiner hohen Süßkraft in zahlreichen Lebensmitteln verwendet wird. Bis heute wird sein Einsatz aufgrund einer uneindeutigen Studienlagen bezüglich potentieller gesundheitlicher Auswirkungen kontrovers diskutiert. Von der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) wird für die Allgemeinbevölkerung eine tägliche Aufnahme von maximal 40 mg pro Kilogramm Körpergewicht empfohlen. Es existieren Studien, welche Aspartam mit einem potentiell erhöhten Krebsrisiko assoziieren (SHAHER et al., 2023) oder - insbesondere in murinen Modellen - mit dem Auslösen von oxidativem Stress in Verbindung bringen. Bezüglich der Fragestellung, wie sich Aspartam auf die zelluläre Lipidhomöostase im Gehirn auswirkt, liegen zum aktuellen Zeitpunkt unzureichende Daten vor. Lipide spielen eine nicht zu vernachlässigende Rolle in der Pathogenese verschiedenster Krankheiten so auch bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz. Die vorliegende Arbeit wird die Auswirkungen von Aspartam auf die Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y WT unter Betrachtung von Parametern des oxidativen Stresses und der Lipidhomöostase thematisieren. Aspartam wird nach seiner oralen Aufnahme im Gastrointestinaltrakt in seine drei Metabolite Asparaginsäure, Phenylalanin und Methanol gespalten. In verschiedenen in dieser Arbeit durchgeführten experimentellen Analysen ließ sich zeigen, dass sowohl die Behandlung der Zellen mit dem Molekül Aspartam als auch die gemeinsame Behandlung mit seinen drei Metaboliten zu signifikant vermehrtem oxidativem Stress im Vergleich zu den Kontroll- Zellen führte. Dies ließ sich an erhöhten Levels von APF-Fluoreszenz und hochregulierter Expression der antioxidativ wirkenden Superoxiddismutasen SOD1 und SOD2 erkennen. Zudem ließ sich in der Elektronenmikroskopie ein Integritätsverlust der Mitochondrien feststellen. Dieser wurde von in Zelllysaten erniedrigtem Cardiolipin-Level, sowie einer gestiegenen Expression der pro- mitophagischen und Fissions-induzierenden Proteine PINK1 und FIS1 begleitet. Die massenspektrometrische Analyse verschiedener Lipid-Spezies ergab eine signifikante Erhöhung der Triacylglycerid- , sowie von Phosphatidylcholin- und -ethanolamin-Spezies. Letztere gelten als die in mamillären Membranen anteilig am meisten vorkommenden Phospholipide. In der elektronenmikroskopischen Analyse ließ sich in den mit Aspartam oder Metaboliten inkubierten Präparaten zudem eine Akkumulation vergrößerter sogenannter Lipid Droplets (Lipidtröpfchen) erfassen. Diese in der Zellkultur erhobenen Daten verdeutlichen die Relevanz der Durchführung weiterer Studien, die die Auswirkungen von Aspartam und seinen Metaboliten auf die zerebrale Lipidhomöostase in vivo erforschen.

1.2. Influence of aspartame and aspartame metabolites on cellular oxidative stress, mitochondria and lipid homeostasis of SH-SY5Y cells Within the last decades there was observed a worldwide increase in overweight and metabolic diseases such as obesity (WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO), 2021; INSTITUTE FOR HEALTH METRICS AND EVALUATION, 2019; ARROYO-JOHNSON, MINCEY, 2016) and type 2 diabetes (REED et al., 2021; GUARIGUATA et al., 2014). These so called “lifestyle diseases” are particularly associated with a change in living conditions, being characterized by too little physical activity as well as a diet which is rich in calories, especially in carbohydrates including short-chain sugars (CLEMENTE-SUAREZ et al., 2023; KOPP, 2019). Since some years, there has been an increasing interest in “alternative” low-calorie food additives in order to replace the high-caloric table sugar (WALBOLT, KOH, 2020; MALEK et al., 2018; SYLVETSKY, ROTHER, 2016; SYLVETSKY et al., 2012). Amongst those can be found the synthetic sweetener aspartame which has a high sweetening power and is used in numerous foods (SCHORB et al., 2023). To the present day, its use is discussed controversially due to inconclusive studies regarding the potential health risks (CZARNECKA et al., 2021). The European Food Safety Authority (EFSA) recommends a maximum daily intake of 40 mg per kilogram of body weight for the general population (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY (EFSA), 2013). There exist several studies linking aspartame to a possibly increased risk of cancer (SHAHER et al., 2023) or with triggering intracerebral oxidative stress in rodents (ASHOK et al., 2015; IYYASWAMY, RATHINASAMY, 2012). However, only little is known regarding the question how aspartame affects cellular lipid homeostasis in the brain. Lipids play a non-negligible role in the pathogenesis of different diseases (MICHOS et al., 2019; HEEREN, SCHEJA, 2021), including neurodegenerative diseases such as Alzheimer's dementia (KAO et al., 2020). The present research work will address the effects of aspartame on the neuroblastoma cell line SH-SY5Y WT focusing at parameters of cellular oxidative stress and lipid homeostasis. Aspartame is cleaved into its three metabolites aspartic acid, phenylalanine and methanol in the gastrointestinal tract after its oral intake (SHAHER et al., 2023; RANNEY et al., 1976). Experimental analyses carried out in this research work showed that both, the treatment of cells with the aspartame molecule as well as the joint treatment with its three metabolites led to a significant increase in oxidative stress compared to control cells. This was evident from increased levels of APF fluorescence and upregulated expression of the antioxidative acting enzymes superoxide dismutase SOD1 and SOD2. In addition, electron microscopy revealed a loss of mitochondrial integrity. This was accompanied by a reduced cardiolipin level in cell lysates, as well as increased expression of the pro-mitophagic and fission-inducing proteins PINK1 and FIS1. Mass spectrometric analysis of various lipid species showed a significant increase in triacylglycerides and phosphatidylcholine- and ethanolamine. The latter are considered to be the most abundant phospholipids in mammalian cell membranes. The electron Zusammenfassung/ Summary 4 microscopic analysis also revealed an accumulation of so-called lipid droplets in the preparations incubated with aspartame or its metabolites. These obtained in vitro data highlight the relevance of conducting further studies in vivo in order to explore the effects of aspartame and its metabolites on cerebral lipid homeostasis.