Failed fracture healing in aged mice - model development, pathophysiology and therapeutic approaches

Abstract

Despite increasing insights in the molecular and cellular basis of bone regeneration, delayed healing and non-union formation still represent a major burden for trauma and orthopedic surgery. Segmental defects, infections, severe soft tissue damage and insufficient mechanical stability are associated with a risk of fracture healing failure. However, in a substantial number of cases the reason for non-union formation remains elusive and, thus, effective treatment approaches are often lacking.

Moreover, the health care system is confronted with a steadily increasing aged population. These geriatric patients demonstrate a plethora of age-related pathologies, including osteoporosis and an impaired capacity for bone healing. The latter makes the treatment of fracture healing failure in these aged patients all the more challenging.

Parathyroid hormone (PTH) is secreted by the parathyroid glands and a key regulator of calcium homeostasis. Moreover, it represents a clinically approved, osteoanabolic drug with pro-osteogenic capacities. However, its effects on non-union formation in aged patients have not yet been investigated.

For the analysis of the pathophysiology of failed fracture healing and the evaluation of promising treatment approaches, preclinical animal models are needed. Notably, fracture healing models in mice have gained increasing interest in recent years due to the wide range of available antibodies and genetically modified knockout-mice. In the past, a non-union model involving a segmental defect, stripping of the periosteum and stabilization with a pin-clip device has been introduced. However, this approach does not mimic a trauma-induced fracture and subsequent healing failure. Therefore, a model with a transverse femoral fracture, additional periosteal cauterization and K-wire stabilization may be more suitable.

In the first study of this thesis, we compared these two approaches for generating a reliable non-union model in mice. The two models were applied in CD-1 mice and the callus tissue was analyzed by means of biomechanical, radiological, histological as well as immunohistochemical analyses at 2, 5 and 10 weeks after surgery. In addition, growth factor expression was analyzed by Western blotting at 2 weeks after surgery. Notably, the results demonstrated after 10 weeks a reliable non-union formation of 100 % in the model with the segmental defect and the pin-clip stabilization (pin-clip model). In the model using a transverse fracture with periosteal cauterization and K-wire fixation (K-wire model), however, after 10 weeks only 10 out of 12 mice showed fracture healing failure. This was associated with an increased expression of pro-osteogenic growth factors and osteoclast activity as well as enhanced bone formation and bending stiffness of the mice femora. However, the callus tissue of animals in the K-wire group demonstrated a lower number of cluster of differentiation (CD)31-positive endothelial cells, indicating a reduced angiogenic capacity after periosteal cauterization. Hence, these findings suggest that the pin-clip model is more suitable for the investigation of non-union formation in mice. The K-wire model with periosteal cauterization, on the other hand, may be applied particularly in preclinical studies investigating the effects of damaged periosteum and a subsequent impaired angiogenic capacity on fracture healing.

In the second study of this thesis, the pin-clip model was established in 18-20 months old CD-1 mice. Additionally, the cellular and biochemical basis of non-unions were characterized and compared with non-unions of young adult animals (3-4 months). For this purpose, the callus tissue of young adult and aged mice was analyzed by biomechanics, X-ray, micro-computed tomography (µCT), histomorphometry as well as immunohistochemistry at 2 and 10 weeks after surgery. Additionally, Western blot analysis was performed at 2 weeks after surgery. All animals in both study groups demonstrated a reliable atrophic non-union formation with rounded bone ends and abundant fibrous tissue within the callus at 10 weeks after surgery. Notably, the segmental defects of aged mice demonstrated a lower expression of bone formation markers as well as a reduced bone formation and vascularization when compared to young adult animals. This was associated with a decreased number of osteoclasts within the callus tissue and an elevated osteoprotegerin (OPG)/receptor activator of NF-ĸB ligand (RANKL) ratio, indicating a reduction of osteoclast activity. The number of macrophages within the callus of aged mice, on other hand, was significantly increased, revealing an enhanced inflammatory response. The study validates for the first time the application of the pin-clip model in aged mice. In addition, it shows that non-unions of geriatric compared to young adult animals demonstrate distinct differences in bone formation, callus remodeling, growth factor expression as well as vascularization and inflammation.

In the third study of this thesis, the effects of systemic PTH treatment on bone regeneration were evaluated using the pin-clip non-union model in aged mice. For this purpose, the animals received a daily dose of 200 µg/kg body weight PTH subcutaneously. The animals of the control group received saline, respectively. The callus tissue of femora was analyzed at 2 and 10 weeks after surgery by X-ray, biomechanics, µCT, histology and immunohistochemistry as well as at 2 weeks after surgery by Western blotting. The data demonstrated a markedly improved bone formation and increased bending stiffness in PTH-treated aged mice when compared to control animals, most likely mediated by an enhanced expression of cyclooxygenase (COX)-2 and phosphoinositide 3-kinase (PI3K) in PTH-treated mice. These findings were associated with a higher number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts and CD31-positive endothelial cells within the callus tissue. In contrast, the number of myeloperoxidase (MPO)-positive granulocytes and CD68-positive macrophages was significantly decreased, indicating a significantly attenuated inflammatory response. In summary, systemic PTH treatment markedly improves bone regeneration in aged mice. Since, PTH is already a clinically approved drug, it represents a promising candidate for the treatment of non-union formation in geriatric patients. Future prospective clinical trials have to evaluate the effectiveness of PTH treatment in cases of delayed healing and fracture healing failure in aged patients and screen for potential side effects. Thereby, this therapeutic approach can be successfully translated into a clinical setting, and may, thus, help to overcome non-union formation in the aged population.

Taken together, the present thesis demonstrates that the K-wire non-union model is inferior for investigating fracture healing failure. This is due to a higher rate of osseous bridging 10 weeks after surgery when compared to the pin-clip model. Moreover, the experiments of the present thesis could establish the more reliable pin-clip model in aged mice. Thereby, the analysis of non-union callus tissue revealed distinct differences in bone formation, callus remodeling, growth factor expression as well as vascularization and inflammation between young adult and aged animals. Finally, the present thesis reveals some promising pro-osteogenic effects of PTH in overcoming non-union formation in the aged. Thus, this hormone is a promising candidate for the translation into the clinical practice.

Eine verzögerte Frakturheilung sowie Pseudarthrosen sind nach wie vor trotz zunehmender Erkenntnisse über die molekularen und zellulären Grundlagen der Knochenregeneration schwerwiegende Komplikationen in der Traumatologie und Orthopädie. Große Substanzdefekte, Infektionen, schwere Weichteilschäden sowie unzureichende mechanische Stabilität bergen ein hohes Risiko für eine ausbleibende Frakturheilung. In einer beträchtlichen Anzahl von Fällen bleibt der Grund für die Bildung einer Pseudarthrose allerdings unklar und dementsprechend fehlt es oft an wirksamen Behandlungsansätzen.

Gleichzeitig ist das Gesundheitssystem mit einem stetig wachsenden Anteil älterer Patienten konfrontiert. Diese geriatrischen Patienten weisen eine Vielzahl altersbedingter Pathologien, wie Osteoporose, und eine beeinträchtigte Knochenregeneration auf. Dies macht die Behandlung älterer Patienten noch anspruchsvoller.

Parathormon (PTH) wird von den Nebenschilddrüsen ausgeschüttet und ist ein wichtiger Regulator der Kalziumhomöostase. Darüber hinaus wird das Hormon bereits zur Behandlung der Osteoporose eingesetzt und besitzt zudem pro-osteogene Eigenschaften. Die Anwendung in der Behandlung von Pseudarthrosen bei geriatrischen Patienten wurde allerdings noch nicht untersucht.

Für die Analyse der Pathophysiologie der Pseudarthrosenbildung und die Erprobung neuer Behandlungsstrategien sind präklinische Tiermodelle unverzichtbar. Dabei stehen Mausmodelle in den letzten Jahren aufgrund einer großen Bandbreite an zur Verfügung stehenden Antikörpern und genetisch veränderten Knockout-Tieren immer mehr im Fokus. In der Literatur wurde bereits ein Pseudarthrose-Modell in der Maus beschrieben, das einen segmentalen Defekt am Femur mit Pin-Clip Stabilisierung und periostalem Stripping verwendet. Dieses Modell hat allerdings den Nachteil, dass es nicht die Situation der ausbleibenden Knochenheilung nach einer traumatisch bedingten Fraktur widerspiegelt. Dafür wäre eine transversale Femurfraktur mit K-Draht Stabilisierung und zusätzlicher Kauterisation des Periosts möglicherweise besser geeignet.

In der ersten Studie der vorliegenden Arbeit wurden die zwei Ansätze für ein Pseudarthrose-Modell in der Maus miteinander verglichen, um zu ermitteln, welcher der beiden valider ist. Die Modelle wurden bei CD-1-Mäusen angewandt, und das Kallusgewebe mittels biomechanischer, radiologischer, histologischer und immunhistologischer Analysen 2, 5 und 10 Wochen nach dem Eingriff untersucht. Zudem wurde die Expression von Wachstumsfaktoren mittels Western blot 2 Wochen nach dem Eingriff analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass im Modell des segmentalen Defektes und Pin-Clip-Stabilisierung (Pin-Clip-Modell) nach 10 Wochen eine zuverlässige Pseudarthrosenbildung von 100 % erreicht wird. In dem Modell mit transversaler Fraktur, Kauterisieren des Periostes und K-Draht-Fixierung (K-Draht-Modell) zeigten nach 10 Wochen nur 10 von 12 Mäusen eine ausbleibende Frakturheilung. Dies war mit einer erhöhten Expression von pro-osteogenen Wachstumsfaktoren und einer vermehrten Osteoklastenaktivität sowie mit einer gesteigerten Knochenneubildung und Biegesteifigkeit der Femora verbunden. Das Kallusgewebe der Tiere in der K-Draht-Gruppe wies allerdings eine verringerte Anzahl cluster of differentiation (CD)31-positiver Mikrogefäße auf, was auf eine eingeschränkte angiogene Kapazität nach dem Kauterisieren des Periostes hindeutet. Diese Ergebnisse belegen, dass das Pin-Clip-Modell für die Untersuchung von Pseudarthrosen in Mäusen besser geeignet ist. Das K-Draht-Modell mit kauterisiertem Periost kann dagegen in präklinischen Studien eingesetzt werden, welche die Auswirkungen von beschädigtem Periost und einer daraus resultierenden beeinträchtigten angiogenen Kapazität auf die Frakturheilung untersuchen.

In der zweiten Studie der vorliegenden Arbeit wurde das Pin-Clip-Modell bei 18-20 Monate alten CD-1-Mäusen etabliert. Darüber hinaus wurden die zellulären und biochemischen Eigenschaften der Pseudarthrosen charakterisiert und mit Pseudarthrosen von jungen erwachsenen Tieren (3-4 Monate) verglichen. Dazu wurde das Kallusgewebe 2 und 10 Wochen nach der Operation mittels Biomechanik, Röntgen, mikro-Computertomographie (µCT), Histomorphometrie und Immunhistochemie analysiert. Weiterhin erfolgten nach 2 Wochen Western blot Untersuchungen. Alle Versuchstiere in beiden Studiengruppen wiesen eine zuverlässige atrophische Pseudarthrosenbildung mit abgerundeten Knochenenden und reichlich fibrösem Gewebe innerhalb des Kallus 10 Wochen nach der Operation auf. Insbesondere zeigten die segmentalen Defekte älterer Mäuse eine geringere Expression von pro-osteogenen Wachstumsfakten sowie eine reduzierte Knochenneubildung und Vaskularisierung im Vergleich zu jungen erwachsenen Tieren. Dies ging mit einer geringeren Anzahl von Osteoklasten im Kallusgewebe und einem erhöhten Verhältnis von Osteoprotegerin (OPG)/receptor activator of NF-ĸB ligand (RANKL) einher, was auf eine geringere Osteoklastenaktivität hindeutet. Die Anzahl der Makrophagen im Kallusgewebe alter Tiere war dagegen deutlich erhöht. Dies deutet auf eine verstärkte Entzündungsreaktion hin. Die Studie bestätigte somit die Validität und Reliabilität des Pin-Clip-Modells bei älteren Mäusen und zeigte zudem, dass atrophe Pseudarthrosen geriatrischer und junger erwachsener Tiere deutliche Unterschiede bei der Knochenbildung, dem Umbau des Kallusgewebes, der Expression von Wachstumsfaktoren sowie der Vaskularisierung und der Entzündungsreaktion aufweisen. In der dritten Studie der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen einer systemischen PTH-Behandlung auf die Knochenregeneration in der alten Maus mit Hilfe des Pin-Clip- Modelles untersucht. Dazu wurde den Tieren täglich eine Dosis von 200 µg/kg Körpergewicht PTH subkutan appliziert. Die Kontrollgruppe erhielt jeweils eine entsprechende Menge an Kochsalzlösung. Das Kallusgewebe der Femora wurde 2 und 10 Wochen nach dem Eingriff durch biomechanische, radiologische, histologische und immunhistochemische Analysen sowie nach 2 Wochen zusätzlich mittels Western blot untersucht. Die Analysen zeigten eine deutlich verbesserte Knochenbildung und erhöhte Biegesteifigkeit bei PTH-behandelten älteren Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren, was wahrscheinlich auf eine verstärkte Expression der Cyclooxygenase (COX)-2 und Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) zurückzuführen ist. Weiterhin zeigte sich eine höhere Anzahl tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positiver Osteoklasten und CD31-positiver Mikrogefäße im Kallusgewebe der PTH-Gruppe. Im Gegensatz dazu war die Zahl der Myeloperoxidase (MPO)-positiven Granulozyten und CD68-positiven Makrophagen im Kallusgewebe der PTH-behandelten Mäuse deutlich verringert, was auf eine abgeschwächte Entzündungsreaktion hindeutet. Es kann festgehalten werden, dass eine systemische PTH-Behandlung die Knochenregeneration bei alten Mäusen substanziell verbessern kann. Da PTH bereits ein klinisch zugelassenes Präparat ist, stellt es einen vielversprechenden Kandidaten zur Behandlung von Pseudarthrosen bei geriatrischen Patienten dar. Künftige prospektive klinische Studien müssen nun die Wirksamkeit der PTH-Behandlung bei verzögerter und fehlgeschlagener Frakturheilung in älteren Patienten bewerten und auf mögliche Nebenwirkungen untersuchen. Auf diese Weise kann dieser therapeutische Ansatz erfolgreich in die klinische Praxis umgesetzt werden, und dazu beitragen, die Behandlung von Pseudarthrosen in der älteren Bevölkerung zu verbessern.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass in der Maus das K-Draht-Modell für die Untersuchung von Pseudarthrosen dem Pin-Clip-Modell unterlegen ist, da es eine höhere Rate an knöcherner Überbrückung 10 Wochen nach der Operation aufweist. Darüber hinaus konnte die vorliegende Arbeit das zuverlässigere Pin-Clip-Modell in alten Mäusen etablieren. Dabei zeigte die Analyse der Pseudarthrose deutliche Unterschiede in der Knochenbildung, Kallusumbau, Wachstumsfaktoren-Expression sowie der Vaskularisierung und Entzündung zwischen jungen erwachsenen und alten Tieren. Schließlich konnte in der vorliegenden Arbeit vielversprechende pro-osteogene Effekte von PTH bei der Behandlung von Pseudarthrose in der alten Maus nachgewiesen werden. Somit ist dieses Hormon ein vielversprechender Ansatz für die Einführung in die klinische Praxis.