Der Einfluss von Vitamin D3 auf die antitumorale Immunantwort, Tumorinitiation und Progression von Plattenepithelzellkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs – Untersuchungen an einem murinen, oralen Karzinogenese-Modell

Abstract

1.1 Deutsche Zusammenfassung Plattenepithelzellkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs (Head and Neck Squamous Cell Carcinomas, HNSCCs) gehören zu den sechs häufigsten Krebsentitäten weltweit. Die Prognose von Noxen-induzierten HNSCCs ist weiterhin mit einer 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit von 50 % schlecht. Die Therapie von Kopf-Hals-Karzinomen bedeutet oftmals eine starke physische und psychische Belastung für den Patienten und geht häufig mit funktionellen und ästhetischen Beeinträchtigungen einher. Das therapeutische Regime ist in fortgeschrittenen oder metastasierten Stadien stark eingeschränkt. In den vergangenen Jahren wurde jedoch durch die Zulassung von Immuncheckpoint-Inhibitoren bei bestimmten Patientengruppen mit fortgeschrittenen oder metastasierten Tumoren ein vielversprechendes therapeutisches Ansprechen erreicht. Diverse Arbeiten konnten antineoplastische Wirkweisen von 1,25-(OH)2 Vitamin D3 aufzeigen. Diese beschriebenen Mechanismen wurden fast ausschließlich in vitro beschrieben, lassen jedoch systemische antiproliferative Mechanismen von Vitamin D3 in vivo erwarten. In diesem Zusammenhang konnten klinische Studien zeigen, dass es signifikante Unterschiede im 25-OH Vitamin D3-Serumversorgungsstatus von Kopf-Hals-Tumorpatienten gibt. Dabei war ein fortgeschrittenes Stadium und eine schlechte Prognose mit defizienten 25-OH Vitamin D3-Serumspiegeln verbunden, während eine deutlich bessere Prognose, ein niedriges Tumorstadium sowie eine verstärkte antitumorale Immunantwort mit hohen 25-OH Vitamin D3-Serumspiegeln assoziiert waren. Aussagekräftige Studien, welche die antitumoralen Wirkweisen von Vitamin D3 in vivo im immunkompetenten Mausmodell untersuchen, gibt es derzeit nicht. Vor diesem Hintergrund ist die Hauptfragestellung dieser Arbeit, welchen Einfluss Vitamin D3 auf die antitumorale Immunantwort, Tumorinitiation und Tumorprogression von Plattenepithelzellkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs an einem murinen, oralen Karzinogenese-Modell hat. Zusätzlich werden die molekularen Wirkungsweisen von Vitamin D3 auf die Tumorzellbiologie in verschiedenen Kopf-Hals-Karzinom-Zelllinien untersucht. Diese Arbeit lässt sich in zwei Projektabschnitte einteilen: Im Rahmen von Zellkulturversuchen wurden HNSCC-Zelllinien mit unterschiedlichen Vitamin D3-Behandlungskonzentrationen über definierte Zeiträume von 96 Stunden behandelt. Die Behandlungseffekte wurden anschließend mittels Western-Blot, Migrations- und Proliferationsassays und RNA-Sequenzierung ausgewertet. Hierbei zeigte sich eine deutliche Reduktion der Migration und Proliferation der FaDu-Zelllinie. Die Inhibition korrelierte mit steigenden Behandlungskonzentrationen von Vitamin D3. Die RNA-Sequenzierung bot ein komplexes Bild von vielen verschiedenen signifikant regulierten Genen und genontologischen Pathways. Es zeigten sich beispielsweise signifikante Regulationen im Bereich des proonkogenen Pathways vom Wnt-Signalweg und immunstimulierender Signalwege, die den folgend beobachteten Mausphänotyp miterklären könnten. Der zweite Projektabschnitt untersuchte die immunologischen Wirkweisen und antitumoralen Effekte von Vitamin D3 im oralen 4NQO-Karzinogenese-Modell an immunkompetenten männlichen C57BL/6NRj-Mäusen. Wir stellten einen 22-wöchigen Vorversuch mit verschiedenen Vitamin D3-Futterkonzentrationen voran, um systemische Toxizität und Verträglichkeitsprobleme der oralen Vitamin D3-Supplementation auszuschließen. Hierbei zeigte sich eine im Zeitverlauf stabile Steigerung des 25-OH Vitamin D3-Serumspiegels unter oraler Vitamin D3-Substitution. In der höchsten getesteten Dosierung mit 200.000 IU/Kg Vitamin D3 wurde eine toxische Wirkweise mit Hauptmanifestationsort im Bereich der Nieren sichtbar. Die in dem Vorversuch ermittelten Vitamin D3-Futterkonzentrationen von 50.000 IU/Kg, 7.500 IU/Kg und 0 IU/Kg wurden im anschließenden Maushauptversuch verwendet. Bei diesem erfolgte eine tägliche klinische Kontrolle der Tiere, eine wöchentliche Fotodokumentation des klinischen Untersuchungsbefundes der enoralen Tumore in Isoflurannarkose, eine venöse Blutentnahme zur Bestimmung des 25-OH Vitamin D3-Serumstatus alle 5 Wochen sowie eine abschließende immunhistochemische Aufarbeitung der tumoralen und peritumoralen Immunpopulationen in den verschieden Behandlungsgruppen. Der Maushauptversuch konnte deutliche tumorsupprimierende Effekte der Vitamin D3-Supplementation aufzeigen. Mit p<0,0001 konnte eine hochsignifikante Reduktion der makroskopisch bestimmten Tumoranzahl in der 50.000 IU/Kg Vitamin D3-Behandlungsgruppe gegenüber der 0 IU/kg Kontrolle nachgewiesen werden. Zusätzlich zeigten sich mit p=0,0137 signifikante Unterschiede in der extralingualen Tumormanifestation zwischen der 0 IU/Kg Kontrollgruppe und der 50.000 IU/Kg Behandlungsgruppe. Unter Vitamin D3-Behandlung kam es zu einer hochsignifikanten Steigerung der antitumoralen Immunpopulationen von CD3+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen und NK-Zellen. Die Anzahl immunsupprimierender FOXP3+ Treg-Zellen im peritumoralen Stroma konnte hingegen durch die Vitamin D3-Behandlung signifikant reduziert werden. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit in vivo und in vitro antitumorale Wirkweisen sowie immunstimulatorische Effekte von Vitamin D3 auf. Diese könnten in Zukunft einen wesentlichen Beitrag zur Weiterentwicklung der medikamentösen Tumortherapie bei Kopf-Hals Tumoren leisten. Insbesondere im Kontext der immer relevanteren Immuncheckpoint-Inhibition könnten die beschriebenen immunmodulierenden Effekte der Vitamin D3-Behandlung dabei synergistische Effekte erzielen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse befinden sich derzeit Folgeuntersuchungen in Arbeit, die diese potenziellen synergistischen Effekte einer Vitamin D3-Behandlung mit Immuncheckpoint-Inhibitoren im Mausmodell untersuchen. Ebenso werden Konzepte für klinische Studien erarbeitet.

1.2 Summary Head and Neck Squamous Cell Carcinomas (HNSCCs) are among the six most common cancer entities worldwide. The prognosis of noxious-induced HNSCCs remains poor, with a 5-year survival probability of 50 %. Therapy for head and neck cancer often imposes a severe physical and psychological burden on the patient and is frequently associated with functional and aesthetic impairment. The therapeutic regimen is severely limited in advanced or metastatic stages. However, in recent years, the approval of immune checkpoint inhibitors in certain groups of patients with advanced or metastatic tumors has yielded promising therapeutic responses. Various papers have demonstrated antineoplastic modes of action of 1,25-(OH)2 vitamin D3. These described mechanisms were almost exclusively in vitro but suggest systemic antiproliferative mechanisms of vitamin D3 in vivo. In this context, clinical studies have shown that there are significant differences in the 25-OH vitamin D3 serum supply status of head and neck tumor patients. In this regard, advanced stage and poor prognosis were associated with deficient 25-OH vitamin D3 serum levels, whereas significantly better prognosis, low tumor stage, and enhanced antitumor immune response were associated with high 25-OH vitamin D3 serum levels. Significant studies investigating the antitumor modes of action of vitamin D3 in vivo in immunocompetent mouse models are currently lacking. The main question of this work is the impact of vitamin D3 on the antitumor immune response, tumor initiation, and tumor progression of head and neck squamous cell carcinoma in a murine oral carcinogenesis model. In addition, the molecular modes of action of vitamin D3 on tumor cell biology in different head and neck carcinoma cell lines will be investigated. This work can be divided into two project sections: Cell culture experiments were performed to treat HNSCC cell lines with different vitamin D3 treatment concentrations for defined periods of 96 hours. Treatment effects were subsequently evaluated by Western blot, migration and proliferation assays, and RNA sequencing. This showed a significant reduction in migration and proliferation of the FaDu cell line. The inhibition correlated with increasing treatment concentrations of vitamin D3. RNA sequencing provided a complex picture of many different significantly regulated genes and genontological pathways. For example, significant regulation in the prooncogenic pathway from the Wnt pathway and immunostimulatory pathways emerged, which may help explain the mouse phenotype observed below. The second stage of the project investigated the immunological modes of action and antitumor effects of vitamin D3 in an oral 4NQO carcinogenesis model using immunocompetent male C57BL/6NRj mice. We preceded a 22-week preliminary experiment with different vitamin D3 dietary concentrations to rule out systemic toxicity and tolerance problems of oral vitamin D3 supplementation. This showed a stable increase in serum 25-OH vitamin D3 levels over time with oral vitamin D3 supplementation. In the highest tested dosage with 200,000 IU/Kg vitamin D3 a toxic mode of action with main site of manifestation in the kidneys became visible. The vitamin D3 dietary concentrations of 50,000 IU/Kg, 7,500 IU/Kg and 0 IU/Kg determined in the preliminary experiment were used in the subsequent main mouse experiment. In this trial, the animals underwent daily clinical monitoring, weekly photodocumentation of the clinical examination findings of the enoral tumors under isoflurane anesthesia, venous blood sampling for determination of the 25-OH vitamin D3 serum status every 5 weeks, and a final immunohistochemical workup of the tumoral and peritumoral immune populations in the different treatment groups. The main mouse experiment was able to demonstrate significant tumor suppressive effects of vitamin D3 supplementation. With p<0.0001, a highly significant reduction in macroscopically determined tumor number was demonstrated in the 50,000 IU/Kg vitamin D3 treatment group compared to the 0 IU/kg control. In addition, there were significant differences in extralingual tumor manifestation between the 0 IU/Kg control group and the 50,000 IU/Kg treatment group with p=0.0137. Vitamin D3 treatment resulted in a highly significant increase in the antitumor immune populations of CD3+ T cells, CD8+ T cells, and NK cells. In contrast, the number of immunosuppressive FOXP3+ Treg cells in the peritumoral stroma was significantly reduced by vitamin D3 treatment. In summary, this work demonstrated in vivo and in vitro antitumor modes of action as well as immunostimulatory effects of vitamin D3. In the future, these could make a significant contribution to the further development of drug-based tumor therapy for head and neck tumors. Especially in the context of the increasingly relevant immune checkpoint inhibition, the described immunomodulatory effects of vitamin D3 treatment could thereby achieve synergistic effects. Based on these results, follow-up studies are currently underway to investigate these potential synergistic effects of vitamin D3 treatment with immune checkpoint inhibitors in the mouse model. Concepts for clinical trials are also being developed.