Engineering probiotic bacteria as living therapeutic agents

Abstract

Living bacterial therapeutics represent an exciting frontier for achieving controlled drug release within the body. However, genetic modules require improvement to control the production and release of therapeutic biomolecules in medically relevant strains. Model probiotic strains like E. coli Nissle 1917 have extensive genetic toolkits but still lack rapidly responsive and stringent genetic switches to regulate drug release. On the other hand, probiotic bacteria from the Lactobacilli family have broader applicability in the body but remain as non-model strains with restrictive genetic programmability. This thesis addresses both these limitations. Firstly, I developed a strategy to achieve strict control over the release of an enzymatically synthesized antibiotic (darobactin) from E. coli Nissle 1917. By combining parts from pre-established genetic switches, I created a thermo-amplifier circuit that released darobactin at pathogen inhibitory levels within a few hours. Secondly, I expanded the genetic toolbox of the probiotic Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 strain with two genetic parts - a strong constitutive promoter (PtlpA) and several type II toxin-antitoxin (TA)-based plasmid retention systems. The performance of these genetic modules in recombinant plasmids was verified using reporter proteins such as mCherry and Staphylococcal nuclease without the need for antibiotic-based selection pressure.

Lebende bakterielle Therapeutika stellen eine spannsende Möglichkeit dar, um eine kontrollierte Freisetzung von Medikamenten im Körper zu erreichen. Die genetischen Module müssen jedoch verbessert werden, um die Produktion und Freisetzung therapeutischer Biomoleküle in medizinisch relevanten Stämmen zu kontrollieren. Probiotische Modellstämme wie E. coli Nissle 1917 verfügen zwar über ein umfangreiches genetisches Instrumentarium, doch fehlt es ihnen noch an schnell reagierenden und stringenten genetischen Schaltern zur Steuerung der Wirkstofffreisetzung. Andererseits sind probiotische Bakterien aus der Familie der Laktobazillen zwar breiter im Körper einsetzbar, bleiben aber als Nicht Modellstämme mit restriktiver genetischer Programmierbarkeit bestehen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit diesen beiden Einschränkungen. Erstens habe ich eine Strategie entwickelt, um die Freisetzung eines enzymatisch synthetisierten Antibiotikums (Darobactin) aus E. coli Nissle 1917 streng zu kontrollieren. Durch die Kombination von Teilen bereits etablierter genetischer Schalter schuf ich einen Thermo-Verstärker-Schaltkreis, der Darobactin innerhalb weniger Stunden in pathogenhemmenden Mengen freisetzt. Zweitens habe ich den genetischen Werkzeugkasten des probiotischen Lactiplantibacillus plantarum WCFS1- Stammes um zwei genetische Teile erweitert - einen starken konstitutiven Promotor (PtlpA) und mehrere Plasmider haltung systeme auf der Basis von Typ-II-Toxin-Antitoxin (TA). Die Leistungsfähigkeit dieser genetischen Module in rekombinanten Plasmiden wurde mit Reporterproteinen wie mCherry und Staphylokokken-Nuklease ohne antibiotischen Selektionsdruck überprüft.