Systems metabolic engineering of electrogenic anaerobic Pseudomonas putida for enhanced 2-ketogluconate production

Abstract

P. putida KT2440 is as a promising host for industrial bioproduction. However, its strictly aerobic nature limits the range of potential applications. Interestingly, when cultured in an anoxic bio-electrochemical system (BES) supplemented with redox mediators, where the anode replaces oxygen as the terminal electron acceptor, this microbe exhibits high bioconversion efficiency. This environment supports the production of valuable chemicals, such as 2-ketogluconate (2KG). To further investigate this electrogenic phenotype, a systems-level analysis through integration of transcriptomic, proteomic, and metabolomic analyses was conducted. P. putida did not grow in the anaerobic BES but produced significant amounts of 2KG, along with smaller amounts of gluconate, acetate, pyruvate, succinate, and lactate. Through 13C tracer studies, it was shown that these products were partially derived from biomass carbon. Over time, the cells underwent global transcriptomic and proteomic changes, mainly related to energy metabolism. These adaptations allowed the cells to sustain significant metabolic activity. Based on the obtained insights, novel mutants were constructed with enhanced 2KG production in terms of titer, yield, and productivity. Additionally, components involved in the transport of redox mediators across the outer membrane were identified. These insights advance our understanding of extracellular electron transfer processes between the cell, mediator, and electrode.

P. putida KT2440 hat sich als vielversprechender Wirt für die industrielle Bioproduktion erwiesen, jedoch schränkt seine strikt aerobe Natur die Einsatzmöglichkeiten ein. Interessanterweise zeigt die Mikrobe in einem anoxischen bio-elektrochemischen System (BES) mit Redox-Mediatoren eine hohe Biokonversionseffizienz, wobei die Anode als Ersatz für Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor dient. In dieser Umgebung produziert P. putida wertvolle Chemikalien wie z.B. 2-Ketogluconat (2KG). Um den elektrogenen Phänotyp zu verstehen, wurden Transkriptom-, Proteom- und Metabolomanalysen integriert. Zwar wuchs P. putida im anaeroben BES nicht, produzierte aber erhebliche Mengen an 2KG, sowie kleinere Mengen an Gluconat, Acetat, Pyruvat, Succinat und Laktat. 13C-Tracer-Studien zeigten, dass diese Produkte teilweise aus Biomasse-Kohlenstoff stammen. Über die Zeit traten globale transkriptomische und proteomische Veränderungen auf, vor allem im Energiestoffwechsel, wodurch die Zellen eine signifikante metabolische Aktivität beibehielten. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden Mutanten entwickelt, die eine verbesserte 2KG-Produktion hinsichtlich Titer, Ertrag und Produktivität aufweisen. Zudem wurden Komponenten identifiziert, die am Transport von Redox-Mediatoren durch die äußere Membran beteiligt sind, was das Verständnis des extrazellulären Elektronentransfers zwischen Zelle, Mediator und Elektrode verbessert.