Anwendung von MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Identifikation der Tematoden Fasciola und Schistosoma

Abstract

Einleitung: Die Schistosomiasis und die Fasziolose sind die humanmedizinisch bedeutsams-ten Trematoden-Infektionen (Saugwurm-Infektionen) und können sowohl zu akuten Erkran-kungen als auch zu chronischen Komplikationen führen. Beide Erkrankungen gehören zu den sogenannten vernachlässigten Tropenkrankheiten (neglected tropical diseases, NTD), deren höchste Krankheitslast in armen Ländern des globalen Südens liegt. Die heutige Routinedi-agnostik der humanen Schistosomiasis und Fasziolose wird vorrangig mittels spezieller mik-roskopischer Untersuchungen durchgeführt. Aufgrund der Seltenheit dieser Infektionen in Europa sinkt die Expertise des Laborpersonals in der korrekten mikroskopischen Speziesi-dentifizierung. Darüber hinaus ist aufgrund der ähnlichen Morphologie der Wurmeier eine speziesspezifische Diagnose nicht immer möglich. Andere diagnostische Methoden wie mo-lekulare PCR-Untersuchungen oder serologische Tests sind zeitaufwendig, teuer und in vie-len Ländern des globalen Südens sowie auch in Europa außerhalb von Referenzlaboren nicht flächendeckend verfügbar. In der schnellen und genauen Diagnostik von Bakterien und Pil-zen ist die sogenannte matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) seit Jahren eine Standard-Identifikationsmethode. Die Vortei-le dieser massenspektrometrischen Untersuchungstechnik liegen besonders darin, dass Er-gebnisse innerhalb von Minuten, hochspezifisch und zu einem geringen Preis pro untersuch-tem Analyten vorliegen. Seit wenigen Jahren wird auch die Anwendung von MALDI-TOF MS für die Diagnostik verschiedener Parasitosen erforscht, und zeigte vielversprechende Ergebnisse. Ziel dieser Arbeit war daher, die erstmalige Anwendung der MALDI-TOF MS zur Detektion von Schistosoma spp. (Schistosoma mansoni und Schistosoma japonicum) so-wie Fasciola spp. (Fasciola gigantica und Fasciola hepatica) zu untersuchen und verschie-dene Einflussfaktoren auf die Identifizierungsraten zu evaluieren. Material und Methoden: Die MALDI-TOF-Analytik basiert auf der „Wiedererkennung“ erregerspezifischer Proteinspektrenprofile, wobei im Massenspektrometer ein Abgleich der gemessenen Spektren mit pathogenspezifischen „main spectra profiles“ (MSPs) erfolgt. Die hierfür erforderliche Datenbank mit MSPs muss nach der Erstellung internen und externen Validationsschritten unterzogen werden. Für die vorliegende Arbeit wurden als Referenz-spektren 13 molekulargenetisch identifizierte Proben von Fasciola spp. aus Nigeria und der Schweiz und 4 Schistosoma spp. Proben aus Japan verwendet. Zur externen Validierung die-ser generierten MSP-Datenbank wurden 111 unbekannte Fasciola spp. Proben und 58 unbe-kannte Schistosoma spp. Isolate untersucht worden. Die Identifikation wurde auf Spezies- bzw. Gattungsebene nach ihren log-scores value (LSV) angegeben, wobei ein LSV von ≥1,7 eine korrekte Identifikation der Gattung und ein LSV von ≥2,0 eine sichere Identifikation der Spezies anzeigt. Untersucht wurden dabei verschiedene Einflussfaktoren auf die Zuverläs-sigkeit der Identifizierung. Zusätzlich wurden die Ergebnisse in Anwendung unüberwachter (Hauptkomponentenanalyse (PCA)) und überwachter (Support Vector Machine (SVM), k-nearest neighbor (KNN), random forest (RF) und partial least square-discriminant analysis (PLS-DA)) Lernalgorithmen (LA) des maschinellen Lernens (ML) klassifiziert, um eine Ver-besserung der Identifikation durch bestimmte LA zu untersuchen. Als Gradmesser zur Ein-schätzung einer Modellleistung wurde der F1-Score eingesetzt, welcher Aufschluss über eine die Sensitivität und Präzision des LA gibt. Ergebnisse: Von 100% (n=169 der Proben konnten Proteinspektren mittels MALDI-TOF MS generiert werden. In der externen Validierung war es möglich, mit der neu erstellten in-house-Database eine korrekte Speziesidentifizierung mit einem LSV >2,0 für 85% (94/111) der Fasciola spp. Proben zu erzielen. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei Schistosoma spp. mit einer speziesspezifischen Identifizierung von 81% (47/58) Proben. Es zeigte sich eine Abhängigkeit der Identifikationsraten vom Entwicklungsstadium: So konnten die Eier von Fasciola spp. nur in 68% (15/22) korrekt identifiziert werden, wenn lediglich von adulten Würmern gewonnene MSPs als Referenz genutzt wurden. Auch gab es Unterschiede zwi-schen verschiedenen Lagerungsmedien von Schistosoma spp.: Wurde RNAlater® eingesetzt, war eine korrekte Identifizierung von 96% (29/30) der Proben möglich, wohingegen nur 36% (10/28) nach Lagerung in Ethanol korrekt identifiziert wurden. Diese Beobachtungen ließen sich auch in verschiedenen LA bestätigen. Dabei stellte der LA SVM bei den meisten Proben den geeignetsten LA dar, jedoch konnten alle LA mit einem F1 Score von über 90% eine gute Modellleistung aufweisen. Schlussfolgerung: Eine erfolgreiche Identifikation von Fasciola- und Schistosoma-Proben mit MALDI-TOF MS ist möglich, wobei das gewählte Lagerungsmedium und auch das Ent-wicklungsstadium des Wurms einen Einfluss auf die Identifikationsraten haben. Weitere Untersuchungen von Würmern aus unterschiedlichen Weltregionen sind erforderlich, um die Methodik erfolgreich zu validieren und ggf. vermehrt in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen.

Background: Schistosomiasis and fascioliasis are part of the neglected tropical diseases, defined by the WHO as the infections with the highest disease burden in poor countries of the global south, causing devastating social, health and economic consequences to more than one billion people. Today the routine diagnostic is performed by microscopic examinations. Due to the rarity of these diseases in Europe, the missing of microscopic expertise is waning outside endemic areas, and the difficulty to distinguish the egg morphology oft different spe-cies, this technique is not sufficient. Other diagnostic methods such as molecular PCR inves-tigations or serological tests are time-consuming, expensive and not widely available outside reference laboratories in many countries of the global South and also in Europe. This indi-cates that new methods of diagnosis are needed. For bacteria and fungi, the MALDI-TOF MS has become an important diagnostic tool, because it provides results within minutes while being highly specific and at a low cost per analyte. During the last years the application of MALDI-TOF MS for the diagnosis of different parasitosis has been investigated and showed promising results. The aim of this work was to investigate the first application of MALDI-TOF MS for the detection of Schistosoma spp. (S.mansoni and S.japonicum) and Fasciola spp. (F.gigantica and F.hepatica) and to evaluate different factors influencing the identifica-tion rates. Methods: For this work, 13 molecularly identified samples of Fasciola spp. and 4 Schisto-soma spp. samples were used as reference spectra. These reference spectra are used in MALDI analysis for the recognition of specific protein spectra profiles. For external valida-tion, 111 unknown Fasciola spp. samples and 58 unknown Schistosoma spp. isolates have been analyzed. Identification was reported at the species or genus level according to their log-scores value (LSV) (LSV> 1.7 correct identification of genus, LSV> 2.0 correctly identi-fied species). In addition, various influencing factors, such as storage media and develop-mental stages on the reliability of identification were investigated. Finally, the results were validated using unsupervised (PCA) and supervised (SVM, KNN, RF, PLS-DA) learning al-gorithms. The F1 score, which provides information about the sensitivity and precision of the LA, was used as a measure to assess model performance. Results: Protein spectra could be generated from 100% (169/169) of the samples by MALDI-TOF MS. For external validation it was possible to assign 85% (94/111) of the Fasciola spp. with correct species identification (LSV> 2.0)) using the newly created in-house-database. Similar results were obtained for Schistosoma spp. with a species-specific identification of 81% (47/58) samples.The strongest influence on the protein spectra had the developmental stage of Fasciola spp. samples. Differences in the spectra of the Schistosoma spp. samples in relation to the storage medium were also found. These results could be confirmed in the ex-amination of the different LA. In this regard, the LA SVM represented the most accurate LA for most samples, however, all LA were able to show good model performance with an F1-Score above 90%. Conclusion: MALDI-TOF MS can reliably distinguish between the species of Schistosoma spp. and Fasciola spp. samples. An influence of different developmental stages or storage media on the generated protein spectra could be observed. This is a further step towards the application of MALDI-TOF MS in clinical routine.