Nicht typisierbarer Haemophilus influenzae unterdrückt die Expression von Surfactant Protein B und Surfactant Protein C in alveolären Epithelzellen vom Typ II

Abstract

Weltweit leiden Millionen Menschen unter chronischen Erkrankungen der Lunge, wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) oder der Mukoviszidose. Gekennzeichnet sind diese unheilbaren Erkrankungen durch einen langjährigen Verlauf mit intermittierend akuten Exazerbationen, meist ausgelöst durch virale oder bakterielle Erreger. Aufgrund der chronischen Entzündung kommt es langfristig zu Veränderungen und Umbauten des Lungenepithels. Durch die geschwächte Immunabwehr in der Lunge werden chronische bakterielle Besiedlungen, häufig mit Non-Typeable Haemophilus influanzae (NTHi) und Pseudomas aeruginosa, begünstigt, was den Krankheitsverlauf negativ beeinflusst. In der Lunge wird NTHi hauptsächlich über die Toll-like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 erkannt. Diese Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs) setzen bei Kontakt mit Pathogenen Signalkaskaden in Gang, in deren Verlauf zahlreiche Entzündungsmediatoren freigesetzt und die zelluläre Immunabwehr aktiviert wird. Auch ein Einfluss von PRRs auf die epithelialen Barrieren der Lunge, die Teil der pulmonalen Immunabwehr sind, ist wahrscheinlich. So gibt es Hinweise, dass die Aktivierung epithelialer Stamm- bzw. Vorläuferzellen über PRRs deren Regeneration und Differenzierung beeinflusst. In den letzten Jahren konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass bei der Regeneration und Differenzierung von Pneumozyten der Wnt (wingless und Int-1) -Signalweg eine bedeutende Rolle spielt. Dickkopf 3 (DKK3) gehört zu der Familie der Dickkopf-Glykoproteine, die bei der Regulation des Wnt-Signalwegs Einfluss haben. Durch welche genauen molekularen Mechanismen die Aktivität von DKK3 reguliert wird, welchen Einfluss DKK3 auf die Regeneration der Lunge, und damit auch auf den Verlauf chronischer Lungenerkrankungen hat, ist bisher nicht bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von NTHi auf die Differenzierung von murinen alveolaren Pneumozyten zu untersuchen. Weiterhin wurde die Bedeutung von TLR2/4 und DKK3 bei der Regeneration und Differenzierung des Lungenepithels betrachtet. Primäre Alveolarepithelzellen wurden aus Wildtypmäusen, Mäusen defizient für TLR2/4 und Mäusen defizient für DKK3 isoliert und in Transwells kultiviert. 48 Stunden später wurde ein Airlift durchgeführt, um Air-Liquid-Interface (ALI) Kulturen zu erhalten. In diesen Kulturen haben die Epithelzellen sowohl Kontakt zur Luft als auch zur Flüssigkeit, wodurch, im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturen, die Epithelzellen der Atemwege in-vitro wesentlich besser nachgebildet und erforscht werden können. Die kultivierten Zellen wurden zum Zeitpunkt des Airlifts oder 24 Stunden nach dem Airlift mit NTHi stimuliert. Der transepitheliale elektrische Widerstand (transepithelial electrical resistance, TEER), die Expression von Differenzierungsmarkern und die Zytokinfreisetzung wurden gemessen. 4 Stimulation mit NTHi am Tag des Airlifts resultierte in einem signifikant erhöhten TEER, sowie einer verminderten Expression von Surfactant Protein B und Surfactant Protein C, Marker für Typ 2 Alveolarzellen. Auch die Expression der Typ 1 Alveolarzellmarker Hopx und Aquaporin 5, sowie Claudin 18, das entscheidend für die Ausbildung von Tight Junctions in Typ 1 Zellen ist, waren vermindert. Dieser Effekt war unabhängig von TLR2/4. Jedoch kam es bei TLR2/4 defizienten Kulturen zu einer verminderten Freisetzung des inflammatorischen Zytokins Keratinocyt-Derived Chemokine (KC). Wurden die Zellen erst 24 Stunden nach Airlift mit NTHi stimuliert, kam es zur Ausbildung eines verminderten TEER. Auch die Expression von Surfactant Protein B, Surfactant Protein C und auch Hopx war vermindert. Hierbei zeigte sich jedoch kein Unterschied in der Expression von Tight-Junction Markern. In den Kulturen aus Dkk3-/--Mäusen wurde ein signifikant verminderter TEER gemessen, jedoch kein Unterschied nach Stimulation mit NTHi. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass NTHi einen Einfluss auf die Ausbildung und Differenzierungsfähigkeit der epithelialen Barriere hat. Dieser Einfluss scheint unabhängig von TLR2/4 zu sein, wird jedoch durch das Vorhandensein von DKK3 beeinflusst. Zukünftige Studien müssen, unter anderem durch Verwendung moderner Methoden, wie Single-cell sequencing, zeigen, über welche zellulären Mechanismen Bakterien, bzw. das Mikrobiom, die Ausprägung epithelialer Stammzellen beeinflussen und welche Rolle dies bei chronischen Lungenerkrankungen, wie der COPD spielt. Das ALI-Regenerationsmodell kann auch genutzt werden, um den Einfluss verschiedener Wirkstoffe auf die epitheliale Barriere und Regeneration zu erforschen um neue Therapieansätze für chronische Lungenerkrankungen, wie die COPD oder die Mukoviszidose zu finden.

Millions of people around the world suffer from chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or cystic fibrosis. These incurable diseases are characterised by a long-term course with intermittent acute exacerbations, usually triggered by viral or bacterial pathogens. The chronic inflammation leads to long-term modifications and remodelling of the lung epithelium. The weakened immune defence in the lungs favours chronic bacterial colonisation, commonly with non-Typeable Haemophilus influanzae (NTHi) and Pseudomas aeruginosa, which has a negative impact on the progression of the disease. In the lungs, NTHi is mainly recognised by the Toll-like receptors TLR2 and TLR4. Upon contact with pathogens, these pattern recognition receptors (PRRs) initiate signalling cascades during which numerous inflammatory mediators are released and the cellular immune defence is activated. It is also likely that PRRs influence the epithelial barriers of the lungs, which are part of the pulmonary immune defence. There is evidence that the activation of epithelial stem and progenitor cells via PRRs influences their regeneration and differentiation. In recent years, various studies have shown that the Wnt (wingless and Int-1) signalling pathway plays an important role in the regeneration and differentiation of pneumocytes. Dickkopf 3 (DKK3) belongs to the family of Dickkopf glycoproteins, which are involved in the regulation of the Wnt -signalling pathway. The exact molecular mechanisms by which the activity of DKK3 is regulated and the influence of DKK3 on lung regeneration, and therefore on the course of chronic lung diseases, are not yet known. The aim of the present study was to investigate the influence of NTHi on the differentiation of murine alveolar pneumocytes. Furthermore, the importance of TLR2/4 and DKK3 in the regeneration and differentiation of the lung epithelium was analysed. Primary alveolar epithelial cells were isolated from wild-type mice, mice deficient for TLR2/4 and mice deficient for DKK3 and cultured in transwells. 48 hours later an airlift was performed to obtain air-liquid interface (ALI) cultures. In these cultures the epithelial cells are in contact with both air and liquid, which, compared to conventional cell cultures, allows the epithelial cells of the airways to be mimicked and researched much better in vitro. The cultured cells were stimulated with NTHi at the time of the airlift or 24 hours after the airlift. Transepithelial electrical resistance (TEER), expression of differentiation markers and cytokine release were measured. Stimulation with NTHi on the day of the airlift resulted in a significantly increased TEER, as well as a reduced expression of surfactant protein B and surfactant protein C, marker for type 2 alveolar cells. The expression of the type 1 alveolar cell markers Hopx and aquaporin 5, as well as claudin 6 18, which is crucial for the formation of tight junctions in type 1 cells, was also reduced. This effect was independent of TLR2/4. But in TLR2/4-deficient cultures there was a reduced release of the inflammatory cytokine keratinocyte-derived chemokine (KC). If the cells were stimulated with NTHi only 24 hours after airlift, a reduced TEER was observed. The expression of surfactant protein B, surfactant protein C and Hopx was also reduced. However, there was no difference in the expression of tight junction markers. In the cultures from Dkk3-/- mice, a significantly reduced TEER was measured, but no difference after stimulation with NTHi. The present study has shown that NTHi has an influence on the formation and differentiation capacity of the epithelial barrier. This influence appears to be independent of TLR2/4, but is influenced by the presence of DKK3. Future studies, including the use of modern methods such as single-cell sequencing, must show the cellular mechanisms by which bacteria or the microbiome influence the development of epithelial stem cells and what role this plays in chronic lung diseases such as COPD. The ALI regeneration model can also be used to investigate the influence of various active substances on the epithelial barrier and regeneration in order to find new therapeutic approaches for chronic lung diseases such as COPD or cystic fibrosis.