Analyse der Pathologie des Nervus opticus in der Frühphase der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis : Hat Probenecid einen Einfluss auf die Oligodendrozyten?

Abstract

Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease of the brain and spinal cord that causes damage to myelin and axons through local infiltration. To date, there is no causative therapy. Therapeutic agents used symptomatically and palliatively often have a variety of side effects. For decades, various animal models of multiple sclerosis have been used to understand the complex pathophysiology and to develop new therapies. In the present work, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model was used. In the past, inhibition of pannexin 1 by probenecid was shown to have a significant effect on the course of experimental autoimmune encephalomyelitis. Prophylactic administration of probenecid prevented the onset of symptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis. With therapeutic administration, stabilization of clinical symptoms occurred. Since the optic nerve is affected in 85% of patients within the first episode of the disease, the present study focused on pathologies in the optic nerve. In a first part of the study, it was analyzed whether the pathology in the optic nerve can also be visualized ultrastructurally in the early phase of experimental autoimmune encephalomyelitis. For this purpose, ultrathin sections of EAE and Sham animals were analyzed comparatively by electron microscopy. The EAE animals were euthanized when a clinical score of 1.5 was reached (i.e. in the early phase of the disease). Compared to the Sham animals, there was a significant difference in the diameter of the axons and, thus, also of the number of axons visualized per image section. This can be explained by the formation of cell oedema with consecutive swelling and circumferential enlargement before the onset of demyelination. In a second part of the experiment, the analysis of inflammatory markers and the quantification of demyelination were used to investigate whether the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis also leads to inflammatory processes with accompanying demyelination of optic nerves. This was done by histology and immunofluorescence staining of frozen sections of the optic nerves and the subsequent analysis with regard to infiltration processes and myelination. In summary, the pathology in the optic nerve can also be seen in experimental autoimmune encephalomyelitis. Significant inflammatory processes and demyelination were observed in the optic nerves of the EAE animals compared to the control group. In a third part of the experiment, the influence of probenecid on the experimental autoimmune encephalomyelitis-associated destruction of oligodendrocytes in the optic nerve was analyzed. This was also done by immunofluorescence staining of frozen sections of the optic nerves and subsequent analysis with regard to infiltration processes and myelination. There were no significant differences in demyelination and inflammatory processes between the optic nerves of the different experimental groups. Only an increased expression of connexin47 was observed in the probenecid-treated animals. Since connexin47 is thought to have important immunomodulatory properties, a protective effect could be attributed to probenecid, despite non-significant differences in deymelination and inflammatory infiltration. Even if not all of the effects observed in the spinal cord occurred in the optic nerve, the probenecid-associated upregulation of connexin47 in particular might be regarded as beneficial.

Multiple Sklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Gehirns und des Rückenmarks, die durch lokale Infiltration zu Schäden an Myelin und Axonen führt. Bisher gibt es keine ursächliche Therapie. Die symptomatisch und palliativ eingesetzten Therapeutika haben häufig eine Vielzahl an Nebenwirkungen. Seit Jahrzehnten werden verschiedene Tiermodelle der Multiplen Sklerose eingesetzt, um die komplexe Patho¬physiologie besser zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurde das Modell der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) genutzt. In der Vergangenheit zeigte sich, dass durch die Inhibierung von Pannexin1 mittels Probenecid ein signifikanter Einfluss auf den Verlauf der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis genommen werden kann. Bei präventiver Gabe von Probenecid konnte das Einsetzen der Symptomatik der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis verhindert werden. Bei therapeutischer Gabe erfolgte eine Stabilisierung der klinischen Symptomatik. Da bei 85% der Patienten mit einem ersten Erkrankungsschub der Nervus opticus betroffen ist, fokussierte die vorliegende Arbeit auf die Pathologien im Nervus opticus. In einem ersten Versuchsteil wurde analysiert, ob die Pathologie im Nervus opticus auch ultrastrukturell in der Frühphase der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis darzustellen ist. Dazu wurden Ultradünnschnitte von Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis- und Sham-Tieren elektronenmikroskopisch vergleichend analysiert. Die EAE-Tiere wurden bei Erreichen eines klinischen Scores von 1,5 (also in der Frühphase der Erkrankung) euthanasiert. Hierbei zeigte sich verglichen mit den Sham-Tieren ein signifikanter Unterschied im Durchmesser der Axone und dadurch bedingt auch in der Anzahl der pro Bildabschnitt dargestellten Axone. Dies ist zu erklären durch die Ausbildung eines Zellödems mit konsekutiver Schwellung und Umfangsvergrößerung vor Beginn der Demyelinisierung. In einem weiteren Versuchsteil wurde durch die Analyse von Entzündungsmarkern, sowie durch Quantifizierung der Demyelinisierung untersucht, ob es bei der Induktion einer Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis in den Versuchstieren auch zu entzündlichen Prozessen mit einhergehender Demyelinisierung im Bereich der Nervi optici kommt. Dies geschah mittels Histologie und Immunfluoreszenzfärbungen von Gefrierschnitten der Nervi optici der Versuchstiere und der anschließenden Analyse bezüglich Infiltrationsprozessen und Myelinisierung. Zusammenfassend lässt sich die Pathologie im Nervus opticus auch in der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis darstellen. Hierbei zeigten sich signifikante Entzündungsprozesse, sowie Demyelinisierung in den optischen Nerven der EAE-Tiere verglichen mit der Kontrollgruppe. In einem angeschlossenen dritten Versuchsteil erfolgte die Analyse des Einflusses von Probenecid auf den MS-assoziierten Untergang von Oligodendrozyten im Nervus opticus. Dies geschah ebenfalls mittels Immunfluoreszenzfärbungen von Gefrierschnitten der Nervi optici der Versuchstiere und der anschließenden Analyse bezüglich Infiltrationsprozessen und Myelinisierung. Hierbei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Demyelinisierung und den Entzündungsprozessen zwischen den Nervi optici der verschiedenen Versuchsgruppen. Einzig konnte in den Probenecid-behandelten Tieren eine vermehrte Expression von Connexin47 beobachtet werden. Da Connexin47 wichtige immunmodulatorische Eigenschaften zugeschrieben werden, könnte man, trotz nicht signifikanter Unterschiede in Demyelinisierung und entzündlicher Infiltration, Probenecid einen protektiven Effekt zuschreiben. Auch wenn im Nervus opticus nicht alle der im Rückenmark beobachteten Effekte auftraten, ist festzuhalten, dass besonders die Probenecid-assoziierte Hochregulation von Connexin47 als positiv betrachtet werden sollte.