Identification of adenosine as an inflammatory mediator triggering astrocyte reactivity to drive the pathogenesis of sepsis-associated encephalopathy

Abstract

Infectious diseases, such as COVID-19, can cause severe systemic inflammation, which may even deteriorate to a life-threatening status called sepsis. Although it is immune-privileged due to its protection by the blood brain barrier, the central nervous system demonstrates rapid responses to systemic inflammation. Previous studies suggest immune signals of systemic inflammation can be mediated by increased humoral proinflammatory cytokines to induce inflammatory responses in the brain. In addition to cytokines, many metabolites such as purines are also upregulated when responding to systemic inflammation, though their contributions to neuroinflammation are still unclear. Here, we show that systemic inflammation induced by peripheral endotoxin lipopolysaccharide (LPS) could rapidly elevate the plasma adenosine level with reaching its peak at 6 hours post LPS injection (hpi). Using in vivo 2P-LSM live imaging of a novel adenosine sensor GRABAdo expressed in astrocytes, we revealed that peripheral administration of adenosine could directly enhance the GRABAdo signal in the brain, suggesting that elevated blood levels of adenosine could increase the extracellular adenosine tone in the brain parenchyma. Furthermore, we detected elevated extracellular adenosine levels in terms of increased GRABAdo signal in the cortex of mice shortly after LPS injection which also peaked at 6 hpi. These results strongly suggest adenosine in the blood can contribute to the extracellular adenosine signal in the brain evoked by systemic inflammation. Combining pharmacological intervention, immunohistochemistry, genetic RiboTag technology and high-throughput RNA sequencing, cytokine array, quantitative PCR, Western blot, and IMARIS-assisted image analysis, we showed that increased adenosine could trigger astrocyte reactivity at the early phase (2-6 hpi) of the systemic inflammation. Using transgenic mouse models, we deleted A1 adenosine receptors (A1ARs), which are Gi/o-coupled, specifically in astrocytes. After a peripheral injection of LPS into these mice, we observed inhibition of an early astrocyte reactivity and reduced expression of proteins related to neuroinflammation (such as CCL2, CCL5, and CXCL1). Subsequently, we found a decrease in microglial activation, less disruption of the blood-brain barrier, improved neuronal functions, and ultimately mitigated depression-like behavior induced by systemic inflammation. We further expressed CNO-mediated hM4Di DREADD stimulation in A1AR-deficient astrocytes at 2 and 4 hpi restored the neuroinflammation and depression-like behavior of the astrocytic-A1AR deficient mice, highlighting astrocytes rather than microglia as early drivers of neuroinflammation. Taken together, our work unveils an important immune-mediated pathway, adenosine signalling via A1ARs, which provokes neuroinflammation by triggering early astrocyte reactivity in systemic inflammation of mice.

Infektionskrankheiten wie COVID-19 können schwere systemische Entzündungen hervorrufen, die sich sogar zu einem lebensbedrohlichen Zustand, der Sepsis, ausweiten können. Obwohl es aufgrund des Schutzes durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) immunprivilegiert ist, reagiert das zentrale Nervensystem (ZNS) schnell auf systemische Entzündungen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass Immunsignale einer systemischen Entzündung durch erhöhte humorale proinflammatorische Zytokine vermittelt werden können, um Entzündungsreaktionen im ZNS auszulösen. Neben Zytokinen werden auch viele Metabolite wie Purine als Reaktion auf systemische Entzündungen hochreguliert, obwohl ihr Beitrag zur Neuroinflammation nach wie vor nicht klar ist. In dieser Studie zeigen wir, dass eine durch das Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöste systemische Entzündung die Adenosinkonzentration im Plasma rasch ansteigen lässt und 6 Stunden nach der LPS-Injektion (hpi) ihren Höhepunkt erreicht. Unter Verwendung von in vivo 2P-LSM Live-Imaging eines neuartigen genetisch kodierten Adenosin-Sensors GRABAdo, der in Astrozyten exprimiert wird, konnten wir zeigen, dass die periphere Verabreichung von Adenosin das GRABAdo-Signal im Gehirn direkt verstärken kann, was darauf hindeutet, dass erhöhte Adenosinspiegel im Blut den extrazellulären Adenosin-Tonus im Gehirnparenchym erhöhen können. Darüber hinaus konnten wir kurz nach der LPS-Injektion erhöhte extrazelluläre Adenosinwerte in Form eines erhöhten GRABAdo-Signals in der Hirnrinde der Mäuse nachweisen, das ebenfalls um 6 hpi seinen Höhepunkt erreichte. Diese begleitenden pathologischen Ereignisse deuten stark darauf hin, dass Adenosin im Blutkreislauf zum gesamten zentralen Adenosin-Signal, das durch systemische Entzündungen hervorgerufen wird, beitragen kann. Durch die Kombination von pharmakologischen Eingriffen, Immunhistochemie, genetischer RiboTag-Technologie und Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung, Zytokin-Array, quantitativer PCR, Western Blot und IMARIS-unterstützter Bildanalyse konnten wir zeigen, dass eine erhöhte Adenosinmenge die Astrozytenreaktivität in der frühen Phase (2-6 hpi) der systemischen Entzündung auslösen kann. In transgenen Mausmodellen haben wir A1-Adenosinrezeptoren (A1ARs), die Gi/ogekoppelt sind, speziell in Astrozyten ausgeschaltet. Nach einer peripheren Injektion von LPS in diese Mäuse beobachteten wir eine Hemmung der frühen Astrozytenreaktivität und eine verringerte Expression von Proteinen, die mit der Neuroinflammation zusammenhängen (wie CCL2, CCL5 und CXCL1). In der Folge stellten wir einen Rückgang der Mikroglia-Aktivierung, eine geringere Störung der Blut-Hirn-Schranke, verbesserte neuronale Funktionen und schließlich eine Abschwächung des durch die systemische Entzündung ausgelösten depressiven Verhaltens fest. Darüber hinaus haben wir den chemogenetischen hM4Di-Rezeptor in A1AR-defizienten Astrozyten exprimiert, um die Gi-Signalisierung nach CNO-Verabreichung bei 2 und 4 hpi zu induzieren, was die Neuroinflammation und das depressionsähnliche Verhalten der astrozytären-A1AR-defizienten Mäuse wiederherstellte und Astrozyten statt Mikroglia als frühe Treiber der Neuroinflammation hervorhob. Unsere Forschung deckt einen bisher unbekannten Signalweg auf, durch den Adenosin als Signalmolekül fungiert, um systemische Entzündungen zu vermitteln und Neuroinflammation durch die Initiierung einer frühen Reaktivität von Astrozyten zu induzieren. Zudem präsentiert diese Studie erstmalig den Nachweis, dass frühe reaktive Astrozyten eine treibende Kraft hinter der Neuroinflammation darstellen und nicht lediglich als Effektoren der reaktiven Mikroglia agieren.