Funktion von Cavβ3, TRPC1 und TRPV2 in Endothelzellen des Mausgehirns

Abstract

Calcium (Ca2+) ist ein entscheidendes Signal-Ion, das an der Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) beteiligt ist, die den Blutkreislauf vom zentralen Nervensystem trennt. Die Endothelzellen der zerebralen Kapillaren sind durch Tight Junctions miteinander verbunden und stellen die Hauptkomponente der BHS dar. In primären mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns (MBMECs) identifizierten wir Transkripte mehrerer Ca2+-permeabler Kanäle, darunter die β3-Untereinheit spannungsabhängiger Calciumkanäle (Cavβ3), den Transient Receptor Potential (TRP) Canonical 1 (TRPC1) und den TRP Vanilloid 2 (TRPV2) Kanal. Um die Rolle von (i) Cavβ3, (ii) TRPC1 und (iii) TRPV2 bei der Regulation der Ca2+-Signalgebung in MBMECs zu untersuchen, verwendeten wir Cacnb3 KO (Cavβ3 KO), Trpc1 KO und Trpv2 KO Mäuse als Kontrolle. (i) Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Ganzzell-Strömen und Depolarisation mit hohem Kalium ergaben keinen signifikanten Cav-Strom bzw. Ca2+-Einstrom in MBMECs. Die Deletion des Cacnb3-Gens führte jedoch zu einer signifikant verstärkten, Thrombin-vermittelten Calciumfreisetzung, ohne den Ca2+-Gehalt des endoplasmatischen Retikulums zu beeinflussen. Um die Rolle der Cavβ3-abhängigen Calcium-Signalgebung bei der Migration von Endothelzellen und der Angiogenese zu bewerten, führten wir in-vitro-Migrations- und -Angiogenese-Assays durch. Die Deletion von Cacnb3 beschleunigte die Migration von MBMECs signifikant, ohne Einfluss auf die Angiogenese in vitro. (ii) In Trpc1 KO MBMECs war der Ca2+-Einstrom nach Depletion der intrazellulären Ca2+-Speicher durch Thapsigargin signifikant erhöht, was auf eine hemmende Wirkung von TRPC1 auf den speicherabhängigen Ca2+-Einstrom hinweist. Die Deletion von Trpc1 beeinflusste jedoch nicht die Migration und Angiogenese von MBMECs in vitro. (iii) Der durch 2-Aminoethoxydiphenylborat (2-APB) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ausgelöste Ca2+-Einstrom war bei MBMECs, die aus Trpv2 KO Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen signifikant reduziert. Unter basalen Bedingungen war die in-vitro-Angiogenese von MBMECs durch das Fehlen von TRPV2 nicht beeinflusst. Die VEGF-induzierte in-vitro-Angiogenese war jedoch in MBMECs, die aus Trpv2 KO Mäusen isoliert wurden, signifikant beeinträchtigt, passend zu den Ergebnissen des Calcium-Imagings. Um zu untersuchen, ob TRPV2 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der BHS in vitro spielt, evaluierten wir die Barrierefunktion von MBMECs durch Messung ihrer Permeabilität für mit Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertem Albumin (FITC-Albumin) oder mit Tetramethylrhodamin konjugiertem Dextran (TRITC-Dextran). Die Durchlässigkeit für FITC-Albumin und TRITC-Dextran bei Trpv2 KO MBMECs war im Vergleich zu Wildtyp-Zellen nicht verändert. In Anwesenheit der proinflammatorischen Zytokine Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-1-β (IL-1β) war die Durchlässigkeit für Albumin signifikant erhöht, aber zwischen beiden Genotypen nicht unterschiedlich. Zusammenfassend demonstrieren diese Daten eine bedeutende Rolle von Cavβ3, TRPC1 und TRPV2 bei der Regulation der intrazellulären Ca2+-Signalgebung in MBMECs und dadurch der Funktion von Endothelzellen.

Calcium (Ca2+) is a key signaling ion involved in maintaining the integrity of the blood-brain-barrier (BBB), which separates the bloodstream from the central nervous system. Brain capillary endothelial cells are interconnected by tight junctions and represent the main component of the BBB. We identified in primary mouse brain microvascular endothelial cells (MBMECs) transcripts of several calcium conducting channels including the β3 auxiliary subunit of voltage-gated calcium channels (Cavβ3), the transient receptor potential (TRP) canonical 1 (TRPC1) and the TRP vanilloid 2 (TRPV2) channel. To investigate the role of (i) Cavβ3, (ii) TRPC1 and (iii) TRPV2 in the regulation of Ca2+-signaling in MBMECs, we used Cacnb3 KO (Cavβ3 KO), Trpc1 KO and Trpv2 KO mice as a control. (i) Electrophysiological recordings of whole-cell-currents and high potassium depolarization did not reveal a significant Cav current or Ca2+ influx in MBMECs. However, deletion of the Cacnb3 gene significantly enhanced thrombin-mediated Ca2+ release without affecting Ca2+ content of the endoplasmic reticulum. To assess the role of Cavβ3-dependent calcium signaling in endothelial cell migration and angiogenesis, we performed scratch migration and endothelial tube formation assays in vitro. Deletion of Cacnb3 significantly accelerated migration of MBMECs without affecting angiogenesis in vitro. (ii) In Trpc1 KO MBMECs, Ca2+ influx following Ca2+ store depletion in the presence of thapsigargin was significantly increased, indicating an inhibitory effect of TRPC1 on store-operated Ca2+ entry. However, deletion of Trpc1 did not impair MBMECs migration and angiogenesis in vitro. (iii) 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)- and vascular endothelial growth factor (VEGF)-evoked Ca2+ influx was markedly reduced in MBMECs isolated from Trpv2 KO mice compared with wild-type. Under basal conditions, MBMECs tube formation was not affected in the ab-sence of TRPV2. However, in agreement with the Ca2+ imaging results, VEGF-induced endothelial cell tube formation was significantly impaired in MBMECs isolated from Trpv2 KO mice. To investigate, whether TRPV2 plays a role in maintaining the integrity of the BBB in vitro, we evaluated the barrier function of MBMECs by measuring its permeability to albumin conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC-albumin), or dextran conjugated to tetramethylrhodamine (TRITC-dextran). The leakage rate of FITC-albumin and TRITC-dextran across Trpv2 KO MBMECs was not changed compared with wild-type cells. In the presence of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-1-β (IL-1β), the leakage rates for albumin were significantly augmented but not different in both genotypes. In summary, these data demonstrate a signifi-cant role of Cavβ3, TRPC1 and TRPV2 in the regulation of MBMECs intracellular calcium signaling and thereby endothelial cell function.