Investigation of the association between receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 expression and the outcome of photodynamic therapy in vivo and in an HPV8-positive organotypic 3D cell culture model

Abstract

Human Papillomaviruses (HPV), particularly the high-risk HPV types 16 and 18, are pivotal in the development of cervical carcinoma and other tumorous entities in the anogenital tract, such as the vulva, as well as in the oropharyngeal region. Also, certain cutaneous beta-HPVs, such as HPV5 and 8, are thought to play a cofactor role of in the development of non-melanocytic skin cancer in epidermodysplasia verruciformis (EV) patients. HPV-associated cancers develop via precancerous lesions, such as mucosal intraepithelial neoplasia, or cutaneous actinic keratoses, respectively. In addition to cutaneous non-melanoma skin cancers, precursor skin lesions such as actinic keratosis or vulvar intraepithelial neoplasia (VIN) are presently addressed through photodynamic therapy (PDT). PDT induces necroptosis, a form of cell death that combines criteria of necrosis and apoptosis and involves the factor "receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3" (RIPK3). Our group had recently shown that RIPK3-dependent necroptosis in HPV-positive tumour cells, induced by dsRNA, strongly activates the immune system. Thus, in contrast to apoptosis, RIPK3-dependent necroptosis represents a form of immunogenic cell death. In this work, we now aimed to investigate the involvement of RIPK3 expression in the response to PDT in skin cancer precursors in vivo or HPV-positive cells in vitro. First, RIPK3 expression in actinic keratoses was analysed. Significant differences in the expression patterns were found. RIPK3 expression in actinic keratoses correlated with the success of PTD in vivo. In VINs, RIPK3 expression decreased significantly with severity. Thus, less RIPK3 was detected in less differentiated tumour tissue. Standard therapy for VINs and vulvar carcinoma is currently radical excision, which is often associated with dramatic physical but also psychological consequences for the affected patients. Whether or not RIPK3 expression in VIN is associated with responsiveness to PDT warrants further investigation. A cutaneous 3D cell culture model was used to study the effects of PDT in vitro. To investigate the role of HPV8 and its influence on RIPK3 expression and effects on PDT treatment outcome, the HPV8 E6 oncogene was expressed in keratinocytes by retroviral gene transfer, which were then subjected to PDT. Keratinocytes transduced with HPV8 E6 exhibited diminished RIPK3 expression after PDT, particularly within the superficial cell layers, in comparison to non-irradiated cultures, despite RIPK3 being suppressed in both conditions. The detection of PDT-dependent DNA double-strand damage by γ-H2AX was limited to the suprabasal cell layers. HPV8 E6-transduced cells exhibited less PDT-dependent DNA damage and were more resistant to PDT overall. Interestingly, basal cell layers were more likely to be stimulated to proliferate in this model. Whether this observation also applies to the in vivo situation remains unclear at present and would need further investigation in the future.

Humane Papillomviren (HPV), insbesondere die sogenannten Hochrisiko-HPV Typen 16 und 18, spielen eine entscheidende Rolle für die Entstehung des Zervixkarzinoms und weiterer Tumorentitäten im Anogenitaltrakt, wie beispielsweise der Vulva, sowie im Oropharynxbereich. Auch wird eine Kofaktor-Rolle bestimmter kutaner beta-HPV, wie HPV5 und 8, bei der Entstehung des nicht-melanozytären Hautkrebses vermutet. Die Entwicklung dieser Krebsarten erfolgt über Krebsvorstufen, mukosale intraepitheliale Neoplasien bzw. kutane aktinische Keratosen. In Ergänzung zu nicht-melanozytären Hautkrebsarten werden derzeit auch Krebsvorstufen wie die aktinische Keratose oder die vulväre intraepitheliale Neoplasie (VIN) mittels photodynamischer Therapie (PDT) behandelt. PDT induziert Nekroptose, eine Form des Zelltods, der Kriterien der Nekrose und der Apoptose vereinigt und den Faktor „Receptor-interacting serine/threonine-protein Kinase 3“ (RIPK3) involviert. Unsere Arbeitsgruppe hatte kürzlich gezeigt, dass HPV-positive Tumorzellen, die durch dsRNA in die RIPK3-abhängige Nekroptose getrieben werden, das Immunsystem stark aktivieren. Im Gegensatz zur Apoptose, stellt die RIPK3-abhängige Nekroptose demnach eine immunogene Zelltodform dar. In dieser Arbeit sollte nun überprüft werden, inwieweit auch das Ansprechen auf eine PDT bei Hautkrebsvorstufen in vivo oder HPV-positiver Zellen in vitro von der RIPK3 Expressionsstärke abhängt. Zunächst wurde die RIPK3 Expression in aktinischen Keratosen untersucht. Es fanden sich erhebliche Unterschiede im Expressionsmuster. In der Tat korrelierte die RIPK3 Expression in aktinischen Keratosen mit dem Erfolg einer PTD in vivo. Bei VINs nahm die RIPK3-Expression mit dem Schweregrad deutlich ab. So wurde in weniger differenziertem Tumorgewebe weniger RIPK3 nachgewiesen. Standardtherapie der VIN und des Vulvakarzinoms ist derzeit die radikale Exzision, was für die betroffenen Patientinnen oftmals mit dramatischen physischen aber auch psychischen Folgen einhergeht. Auf Grundlage dieser Daten wäre es sinnvoll zukünftig zu untersuchen, ob über die Bestimmung der RIPK3 Expression vor Therapiebeginn Patientinnen selektiert werden könnten, deren VINs besonders gut auf PDT ansprechen, um ihnen eine radikale Exzisionstherapie zu ersparen. Mit Hilfe eines kutanen 3D-Zellkulturmodells wurden die Auswirkungen der PDT auch in vitro untersucht. Um die Rolle von HPV8 und dessen Einfluss auf die RIPK3 Expression und Auswirkungen einer PDT-Behandlung zu untersuchen, wurden das HPV8 E6 Onkogen mittels retroviralem Gentransfer in Keratinozyten zur Expression gebracht und einer PDT unterzogen. Die RIPK3 Expression in HPV8 E6-tranduzierten Zellen nach einer PDT-Behandlung fiel niedriger aus, verglichen mit der Kontrollgruppe, wobei auch hier eine Reduktion zu verzeichnen war. Vor allen in den oberflächlichen Schichten ließ sich kaum RIPK3 nachweisen. Der Nachweis PDT-abhängiger DNA-Doppelstrang-Schäden mittels γ-H2AX begrenzte sich allerdings auf die suprabasalen Zellschichten. HPV8 E6-transduzierte Zellen wiesen weniger PDT-abhängige DNA-Schäden auf und waren insgesamt resistenter gegen eine PDT. Interessanterweise wurden basale Zellschichten in diesem Modell eher zur Proliferation angeregt. Ob diese Beobachtung auch auf die in vivo Situation übertragbar ist, bleibt derzeit unklar und müsste in Zukunft weiter untersucht werden.