Multidisciplinary analyses reveal distinct intramembrane positioning of UBXD8 in endoplasmic reticulum and lipid droplet membranes

Abstract

Lipidtropfen (LDs) sind allgegenwärtige zytoplasmatische Organellen, die für die Speicherung von Fett in Form von neutralen Lipiden, insbesondere Triacylglycerolen (TAGs), verantwortlich sind. Aufgrund ihrer integralen Rolle im Fettstoffwechsel wird den LDs eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl menschlicher Krankheiten zugeschrieben. In der Vergangenheit haben Studien gezeigt, dass eine Reihe von Proteinen durch hydrophobe Haarnadel-Domänen und amphipathische Helices spezifisch mit der Phospholipid-Monolage assoziiert sind. Dieses dynamische LD-Proteom spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Funktionen dieser Organelle im zellulären Stoffwechsel. Die LD-Proteine, die auf das endoplasmatische Retikulum (ER) ausgerichtet sind, assoziieren nachweislich mit der ER-Doppelschicht, indem sie eine monotopische Haarnadel-Topologie annehmen. Es wurde vermutet, dass diese einzigartige topologische Assoziation mit dem zytosolischen Blatt des ER die laterale Diffusion von LD-Haarnadelproteinen aus dem ER in die LDs fördert. In dieser Studie habe ich UBXD8 als Modell-Haarnadelprotein verwendet, das sich sowohl in der ER-Doppelschicht als auch in der LD-Monolayer-Membran befindet. Eine Kombination aus multidisziplinären Ansätzen wie biochemischen Cystein-Lösungsmitteltests, Intramembran-Vernetzung und atomistischen MD-Simulationen wurde verwendet, um die Intramembran-Positionierung der in die Membran eingebetteten Region von UBXD8 sowohl in der ER-Doppelschicht als auch in den LD-Monolayer-Membranen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die in die Membran eingebettete Region von UBXD8 in zwei verschiedenen physikalisch-chemischen Membranumgebungen unterschiedliche Konformationen annimmt. In der ER-Doppelschicht wurde festgestellt, dass UBXD8 tief integriert ist und eine V-förmige Topologie mit zwei antiparallelen ⍺-Helices annimmt, die einander gegenüberliegen, während in LD-Monoschichten die in die Membran eingebettete Region von UBXD8 eine offenere und flachere Konformation annimmt. Die Berechnungen der freien Energie am Rand der LD in Kontinuität mit der planaren Doppelschicht unterstützten eine stabile Deep-V-Konformation für UBXD8 in der ER-Doppelschicht. Damit sich UBXD8 vom ER auf die LDs aufteilen kann, ist daher eine strukturelle Umlagerung von der Deep-V- zur Flat-Konformation unvermeidlich. Die zusätzlichen Faktoren, die diesen Übergang regulieren, wie z. B. akzessorische Proteine, müssen jedoch noch identifiziert werden. Diese Studie stellt ein neues Paradigma vor, das darauf hindeutet, dass die Abtrennung von Haarnadelproteinen aus dem ER in die LDs möglicherweise nicht nur von passiver Diffusion abhängt, sondern dass einige Proteine eine strukturelle Umstrukturierung durchlaufen müssen. In Zukunft könnten weitere Studien, die biochemische Experimente mit MD-Simulationen kombinieren, dazu beitragen, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Verteilung von Haarnadelproteinen vom ER zu den LDs steuern.

Lipid droplets (LDs) are ubiquitous cytoplasmic organelles, responsible for storing fat in the form of neutral lipids, specifically triacylglycerols (TAGs). Given their integral role in lipid metabolism, LDs have been implicated in playing a crucial role in a plethora of human diseases. In the past, studies have revealed that a diverse set of proteins specifically target and associate with the phospholipid monolayer through hydrophobic hairpin domains and amphipathic helices. This dynamic LD proteome plays a crucial role in regulating the functions of this organelle in cellular metabolism. The LD proteins targeted to the endoplasmic reticulum (ER) have been shown to associate with the ER bilayer adopting a monotopic hairpin topology. It has been suggested that this unique topological association with the cytosolic leaflet of ER drives the lateral diffusion of LD hairpin proteins from the ER-to-LDs. In this study, I employed UBXD8 as a model hairpin protein which resides in both the ER bilayer and LD monolayer membranes. A combination of multidisciplinary approaches such as biochemical cysteine solvent-accessibility assay, intramembrane crosslinking, and atomistic MD simulations were used to determine the intramembrane positioning of UBXD8 membrane-embedded region in both the ER bilayer and LD monolayer membranes. The findings from this study revealed that the UBXD8 membrane-embedded region adopts distinct conformations in two different physicochemical membrane environments. In the ER bilayer, UBXD8 was found to be deeply integrated adopting a V-shaped topology with two antiparallel ⍺-helices facing each other, whereas in LD monolayers the UBXD8 membrane-embedded region adopted an open and shallow conformation. The free energy calculations at rim of LD in continuity with planar bilayer further supported a stable deep-V conformation for UBXD8 in the ER bilayer. Therefore, in order for UBXD8 to partition from the ER-to-LDs, a structural rearrangement from deep-V to shallow conformation is inevitable. The additional factors regulating this transition such as accessory proteins, however, need to be identified. This study introduces a novel paradigm, suggesting that the partitioning of hairpin proteins from the ER-to-LDs may not be solely reliant on passive diffusion, and may necessitate some proteins to undergo a structural rearrangement. In the future, more studies combining biochemical experiments with MD simulations could help us in unravelling the molecular mechanisms that govern the partitioning of hairpin proteins from the ER-to-LDs.