Sex-Dependent Impact of Cytokines on Cytotoxic Lymphocyte Function during Aging

Abstract

Cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells are effector immune cells which are affiliated with the adaptive and innate immune system, respectively. Their primary tasks are the identification and active elimination of their target cells, including infected or degenerated cells, through different killing pathways. One of these killing pathways is driven by the secretion of effector molecules perforins and granzymes that are stored in lytic granules within the immune cells, inducing cell death. Both cytotoxic T lymphocytes and natural killer cell activity can be induced by supplementation with the cytokine interleukin-2, which then creates a positive feedback loop to further enhance activation. Interleukin-2 signaling begins at the interleukin-2 receptor, consisting of the three subunits CD25, CD122, and CD132, which then activate different downstream pathways, controlling differentiation, proliferation, and survival of the immune cells. Two other fundamental properties influencing the immune response of effector immune cells are age and sex/gender, which impact the abundance and functionality of effector cells, resulting in different susceptibilities to diseases. However, little is known about the sex- and age- differences in interleukin-2 regulation in both mouse and human; therefore, this study aims to investigate the differences in activation, exhaustion, effector molecule expression and secretion in cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells of mice and human across age and sex. Cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells were isolated from mouse and human donors of varies ages and both sexes, stimulated accordingly with interleukin-2, and analyzed regarding cytotoxicity using a real time killing assay, expression of surface markers and effector molecules using flow cytometry. Lastly, the secretion of effector molecules and cytokines was quantified using the LegendPlexTM system. Analysis of murine cytotoxic T lymphocytes from both sexes revealed that while there was no difference in interleukin-2 response in the adult mice, the elderly mice showed a strong sex- specific interleukin-2-mediated decline cytotoxicity in the male mice that was absent in the females. In general, adult mice cytotoxic T lymphocytes were more susceptible to fluctuations in interleukin-2 concentration compared to their elderly counterparts. Only the neutralization of autocrine interleukin-2 inhibited cytotoxicity in all tested cohorts except elderly female mice. These differences are due to enhanced activation as well as expression and secretion of effector molecules but are independent of viability, subtype distribution, and proliferation. In murine spleen natural killer cells, no general interleukin-2-dependence was observed. However, in all but one cohort, cytotoxicity peaked at 500U IL-2, suggesting that this is an ideal interleukin-2 concentration for natural killer cell stimulation. Both the subtype distribution and the expression of activating natural killer cell receptors showed tendencies depending on the interleukin-2 concentration, with an increasing abundance in mature natural killer cells with decreasing interleukin-2 concentrations. In contrast to cytotoxic T lymphocytes, a sex-specific differences were not found in the elderly but rather in adult mice, where the females exhibited significantly higher cytotoxicity compared to their male counterparts. Murine blood natural killer cells, though more abundant percentagewise, showed almost no cytotoxic activity. This was generally contradicting the higher abundance of mature natural killer cells but in accordance with the higher expression of inhibitory receptors. Notably, elderly female mice’s blood natural killer cells exhibited lower cytotoxicity due to lower expression of activating receptors. In natural killer cells healthy human donors, interleukin-2 significantly influenced almost all analyzed parameters, such as cytotoxicity, the expression of activating receptors and exhaustion markers, as well as the expression and secretion of effector molecules, which significantly increased under interleukin-2 supplementation. However, only few sex-specific differences were observed as cytotoxicity tended to be higher in women after interleukin-2 treatment most likely due to a higher expression of activating receptors. This study functionally characterized cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells in the context of interleukin-2 dependence across age and sex. It reveals species-, tissue-, age- and sex-specific differences in interleukin-2 response, indicating diverging regulatory mechanisms of the immune system in mouse and human.

Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen sind Effektorzellen des Immunsystems, welche jeweils zum erworbenen und angeborenen Immunsystem gehören. Ihre primären Aufgaben liegen in der Identifikation und aktive Eliminierung ihrer Zielzellen, welche infizierte aber auch entartete Zellen beinhalten, durch verschiedene zytotoxische Signalwege. Einer dieser Signalwege nutzt die Sekretion von Effektormolekülen wie Perforin und Granzymen, welche in den Zellen in Form von lytischen Granula gelagert werden, um den Tod der Zielzelle zu induzieren. Sowohl T-Zellen als auch natürliche Killerzellen können durch die Gabe des Zytokins Interleukin-2 aktiviert werden, welches eine positiven Rückkopplungsschleife auslösen kann, um die Aktivierung zu verstärken. Der IL-2 Signalweg beginnt bei dem Interleukin-2 Rezeptor, bestehend aus den drei Untereinheiten CD25, CD122 und CD132, über den anschließend verschiedene nachgeschaltete Signalwege aktiviert werden, welche unter anderem die Differenzierung, Proliferation und das Überleben der Immunzellen kontrollieren. Zwei weitere fundamentale Eigenschaften, welche die Immunantwort beeinflussen sind das Alter und das Geschlecht (englisch sex und gender), die unter anderem Einfluss auf die Verteilung und Funktionalität dieser Effektorzellen haben, wodurch es zu verschiedenen Prädispositionen in Bezug auf Erkrankungen kommt. Jedoch ist nur sehr wenig zu der Interleukin-2 Regulation dieser Alters- und Geschlechtsbedingter Unterschiede bekannt, weder in der Maus noch im Menschen. Daher soll im Rahmen dieser Arbeit die Aktivierung, Erschöpfung, sowie die Expression und Sekretion von Effektormolekülen in humanen und murinen T-Zellen und natürliche Killerzellen in Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht untersucht werden. Die T-Zellen und natürliche Killerzellen wurden dafür zunächst aus der Maus oder menschlichen Spendern unterschiedlichen Alters und Geschlechts isoliert, mit Interleukin-2 stimuliert und anschließend in Bezug auf Zytotoxizität mittels Echtzeit Zytotoxizitätsassays, sowie der Expression von Oberflächenmarkern und Effektormolekülen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zuletzt wurde die Sekretion der Effektormoleküle und anderer Zytokine mit Hilfe des LegendPlexTM Systems quantifiziert. Die Analyse muriner T-Zellen aus beiden Geschlechtern zeigte, dass es keine geschlechtsbedingten Unterschiede bei den adulten Mäusen gab, allerdings gab es in den älteren männlichen Mäusen einen starken Interleukin-2-abhängigen Abfall in der Zytotoxizität, welcher bei den weiblichen Mäusen nicht feststellbar war. Grundsätzlich waren die T-Zellen aus den adulten Mäusen bedeutend anfälliger für Schwankungen in der Interleukin-2 Konzentration im Vergleich zu den älteren. Jedoch, lediglich die Neutralisation von autokrinem Interleukin-2 erreichte eine vollständige Inhibition der Zytotoxizität in allen getesteten Kohorten außer den gealterten Weibchen. Dieser Unterschied ist auf eine erhöhte Aktivierung, sowie Expression und Sekretion von Effektormolekülen zurückzuführen, ist allerdings unabhängig von Viabilität, Subtypenverteilung und Proliferation. In murinen natürliche Killerzellen konnte hingegen keine generelle Interleukin-2-Abhängigkeit beobachtet werden. Jedoch zeigte sich in allen Kohorten außer einer, dass die Zytotoxizität bei einer Interleukin-2 Konzentration von 500U am höchsten ist, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei um eine ideale Interleukin-2 Konzentration zur Stimulation von natürliche Killerzellen handeln könnte. Sowohl die Subtypenverteilung als auch die Expression der aktivierenden natürliche Killerzell-Rezeptoren zeigte Interleukin-2-abbhängige Tendenzen mit steigendem Vorkommen reifer natürliche Killerzellen mit fallenden Interleukin-2 Konzentrationen. Im Gegensatz zu T-Zellen konnte kein geschlechtsspezifischer Unterschied in den älteren Mäusen gefunden werden, sondern in den adulten Mäusen, bei denen erneut die Zellen aus den Weibchen eine erhöhte Zytotoxizität zeigten. Murine natürliche Killerzellen aus dem Blut, obwohl sie einen höheren prozentualen Anteil haben, zeigten fast keine zytotoxische Aktivität. Dies steht in Widerspruch zu dem erhöhten Vorkommen reifer natürliche Killerzellen, entspricht allerdings der erhöhten Expression inhibitorischer natürliche Killerzell-Rezeptoren. In natürliche Killerzellen aus gesunden menschlichen Probanden hatte die Gabe von Interleukin-2 einen signifikanten Einfluss auf alle untersuchten Parameter, unter anderem auf die Zytotoxizität, die Expression aktivierender Rezeptoren und Erschöpfungsmarker, sowie der Expression und Sekretion von Effektormolekülen, welche alle unter Interleukin-2 Gabe zunahmen. Allerdings zeigten sich hier fast keine geschlechts-spezifischen Veränderung, wobei eine leichte Tendenz zur erhöhten Zytotoxizität nach Interleukin-2 Gabe in Frauen zu finden war, vermutlich aufgrund der erhöhten Expression aktivierender natürliche Killerzell- Rezeptoren. In dieser Studie wurden zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen auf ihre Interleukin-2 Abhängigkeit im Kontext des Alterns und des Geschlechts funktionell charakterisiert. Dabei konnten Spezies-, Gewebe-, Alters- und Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Interleukin-2 Antwort festgestellt werden, welche auf Divergenzen in den zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen des Immunsystems von Maus und Mensch hindeuten.