In vitro Untersuchungen zur Regulation von p53-, Notch- und Vitamin D-Signalwegen bei der Photokarzinogenese des kutanen Plattenepithelkarzinoms

Abstract

Die UVB-Strahlung der Sonne hat auf die Photokarzinogenese des kutanen Plattenepithelkarzinoms zwei entgegengesetzte Auswirkungen. Einerseits fördert sie als Karzinogen dessen Entstehung, andererseits hat sie über die kutane Bildung von Vitamin D und der Induktion von DNA-Reparaturmechanismen auch einen anti-karzinogenen, schützenden Einfluss. Bei der Photokarzinogenese wird aktuell von einem mehrstufigen Prozess ausgegangen. In der Initiationsstufe verursacht die UVB-Strahlung die Bildung von Pyrimidin-Dimeren, auf diesen molekularen Strukturschaden der zellulären DNA folgt die Promotionsstufe, in der die Expression von Genen, die das Zellwachstum regulieren, moduliert wird. Ziel dieser Arbeit war es an einem Zellkulturmodell die Wirkungen der UVB-Strahlung in verschiedenen Stufen der Photokarzinogenese genauer zu charakterisieren. Dabei lag ein besonderes Interesse bei der Analyse möglicher Interaktionen der Signalwege, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Initiierung und Promotion des kutanen Plattenepithelkarzinoms zugeschrieben wird (p53-, Notch- und Vitamin D-Signalweg). Hierfür untersuchten wir den Einfluss von UVB-Strahlung (keine Bestrahlung, 50mJ/cm2, 200mJ/cm2) und von 1,25(OH)2D3 auf drei verschiedene Zelltypen in vitro. Diese Zellen repräsentieren verschiedene Stadien der Photokarzinogenese des kutanen Plattenepithelkarzinoms und weisen eine unterschiedliche p53-Funktionalität auf (primäre Keratinozyten - funktionell intaktes p53 als Modell für „normale Haut“, HaCaT-Zellen -punktmutiertes p53, Modell für die präkanzeröse aktinische Keratose und SCL-1-Zellen - Fehlen des p53-Proteins, Modell für das kutane Plattenepithelkarzinom). Wir analysierten die Transkriptmengen ausgewählter Gene mittels quantitativer Real-Time-Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) und teilweise auch entsprechende Proteinmengen mittels Westernblotting. Die Analyse der Transkriptmengen wichtiger Gene des Notch- und p53-Signalwegs spricht für eine pathologisch veränderte UVB-induzierte und teilweise auch 1,25(OH)2D3-induzierte Modulation in den drei verschiedenen Zelltypen, und zwar sowohl auf den Stufen der Initiation (HaCaT) als auch beim komplett malignen Phänotyp (SCL-1). So zeigte sich beispielsweise nach der Behandlung mit 1,25(OH)₂D₃ in den primären Keratinozyten eine signifikante Abnahme der TAp53-Transkriptmenge um etwa den Faktor 0.5 in unbestrahlten und moderat-UVB bestrahlten Zellen (50mJ/cm2). Interessanterweise ließ sich diese Vitamin D-assoziierte Reduktion der TAp53-Transkriptmenge in den primären Keratinozyten nicht mehr nachweisen, wenn die Zellen mit einer hohen UVB-Strahlung (200mJ/cm2) konfrontiert wurden. Im Gegensatz dazu ließ sich in den HaCaT-Zellen eine solche Vitamin D-assoziierte Reduktion der TAp53-Transkriptmenge nur in den Hochdosis-bestrahlten Zellen nachweisen. In Übereinstimmung mit der verminderten TAp53-Transkriptmengen in ungestressten primären Keratinozyten nach 1,25(OH)2D3-Behandlung fand sich auch bereits früh nach der Vitamin D-Exposition (4h) eine Reduzierung der TAp53-Proteinmenge. 1,25(OH)₂D₃ scheint somit in gesunden Keratinozyten die Menge an TAp53 Protein zu verringern. Dieser Effekt scheint durch starke UVB-induzierte DNA-Schädigung aufgehoben zu werden, nicht jedoch in den punktmutierten HaCaT-Zellen. Eine ähnliche Beobachtung ließ sich auch hinsichtlich des NOTCH1-Gens machen, auch hier ließ sich in den 1,25(OH)2D3-behandelten primären Keratinozyten eine reduzierte NOTCH1-Transkriptmenge nachweisen, nicht mehr jedoch in den Zellen mit höheren UVB-Strahlendosen sowie HaCaT- und SCL-1-Zellen. Darüber hinaus fanden wir nach UVB-Behandlung (200mJ/cm2) in den primären Keratinozyten eine signifikante Zunahme der ∆Np73- und JAG2-Transkriptmengen während es in den HaCaT- bwz. in den SCL-1-Zellen zu einer signifikanten Abnahme dieser Transkriptmengen kam. Gleichzeitig konnten wir infolge der UVB-Bestrahlung (200mJ/cm2) eine vermehrte NOTCH2-Transkriptmenge in den primären Keratinozyten und HaCaT-Zellen nachweisen, wohingegen in den SCL-1-Zellen eine Abnahme zu beobachten war. Diese Beobachtung spricht für eine gestörte UVB-induzierte Regulation der NOTCH2-Transkription, welche erst auf der Stufe des kompletten malignen Phänotyps besteht. In dieser Arbeit konnten wir die Auswirkungen der UVB-Strahlung auf die Photokarzinogenese näher charakterisieren. Unsere Ergebnisse sprechen für eine veränderte Regulation der Transkription von Genen des p53- und Notch-Signalwegs in primären, immortalisierten und transformierten Keratinozyten infolge unterschiedlicher UVB-Strahlendosen sowie teilweise auch einer 1,25(OH)2D3-Behandlung. Abhängig vom jeweiligen Gen lassen sich diese sowohl auf der Stufe initiierter Zellen (HaCaT) als auch in Zellen mit komplett malignem Phänotyp (SCL-1-Zellen) nachweisen. Zudem zeigt sich eine 1,25(OH)2D3-assoziierte Reduktion der TAp53- und NOTCH1-Transkriptmengen in primären Keratinozyten, welche sich in dieser Art und Weise in den HaCaT- und SCL-1-Zellen nicht nachweisen lässt. Hinsichtlich der verminderten TAp53-Transkriptmenge in den mit Vitamin D-behandelten UVB-Hochdosis- bestrahlten HaCaT-Zellen ließe sich diskutieren, ob eine 1,25(OH)2D3-Behandlung in HaCaT-Zellen den dritten Schritt der Photokarzinogenese (die Progression) nicht sogar begünstigen könnte. Das Fehlen dieses Effektes in den SCL-1-Zellen könnte darauf hinweisen, dass die Vitamin D-regulierte Transkription von TAp53 und NOTCH1 mit der Anwesenheit von Wildtyp-p53-Protein korreliert. Inwieweit diese Unterschiede tatsächlich durch eine unterschiedliche p53-Funktionalität bedingt sind und inwieweit diese Unterschiede an der Pathogenese beteiligt sind, muss durch zukünftige Untersuchungen geklärt werden.

UVB radiation from the sun has two opposing effects on the photocarcinogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma. On the one hand, as a carcinogen it promotes its development, on the other hand it also has an anti-carcinogenic, protective influence via the cutaneous formation of vitamin D and the induction of DNA repair mechanisms. Photocarcinogenesis is currently assumed to be a multi-stage process. In the initiation stage, UVB radiation causes the formation of pyrimidine dimers. This molecular structural damage to the cellular DNA is followed by the promotion stage, in which the expression of genes that regulate cell growth is modulated. The aim of this work was to use a cell culture model to characterize the effects of UVB radiation in different stages of photocarcinogenesis in more detail. Of particular interest was the analysis of possible interactions of signaling pathways that are thought to play a key role in the initiation and promotion of cutaneous squamous cell carcinoma (p53, notch and vitamin D signaling pathways). For this purpose, we investigated the influence of UVB radiation (no irradiation, 50mJ/cm2 , 200mJ/cm2 ) and of 1,25(OH)2D3 on three different cell types in vitro. These cells represent different stages of photocarcinogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma and exhibit different p53 functionality (primary keratinocytes - functionally intact p53 as a model for "normal skin", HaCaT cells - dot-mutated p53, model for precancerous actinic keratosis and SCL-1 cells - lack of p53 protein, model for cutaneous squamous cell carcinoma). We analyzed the transcript levels of selected genes by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT PCR) and partially also corresponding protein levels by western blotting. The analysis of the transcript levels of important genes of the notch and p53 signaling pathway indicates a pathologically altered UVB-induced and partially 1,25(OH)2D3 -induced modulation in the three different cell types, both at the initiation stages (HaCaT) and in the complete malignant phenotype (SCL-1). As an example, after treatment with 1,25(OH)2D3 in primary keratinocytes, there was a significant decrease in TAp53 transcript levels by a factor of approximately 0.5 in unirradiated and moderate-UVB irradiated cells (50mJ/cm2 ). Interestingly, this vitamin D-associated reduction in TAp53 transcript levels could no longer be detected in primary keratinocytes when the cells were exposed to high UVB radiation (200mJ/cm2 ). In contrast, in the HaCaT cells, such a vitamin D-associated reduction in TAp53 transcript levels was only detected in the high-dose irradiated cells. In agreement with the reduced TAp53 transcript levels in unstressed primary keratinocytes after 1,25(OH)2D3 treatment, a reduction in TAp53 protein levels was also found early after vitamin D exposure (4h). 1,25(OH)₂D₃ thus appears to reduce the amount of TAp53 protein in healthy keratinocytes. This effect appears to be reversed by strong UVB-induced DNA damage. V A similar observation could also be made with regards to the NOTCH1 gene; here, too, a reduced NOTCH1 transcript amount could be detected in the 1,25(OH)2D3-treated primary keratinocytes, but no longer in the cells with higher UVB radiation doses as well as HaCaT and SCL-1 cells. Furthermore, we found a significant increase in ∆Np73 and JAG2 transcript levels in the primary keratinocytes after UVB treatment (200mJ/cm2 ), while there was a significant decrease in these transcript levels in the HaCaT and SCL-1 cells. At the same time, UVB irradiation (200mJ/cm2 ) increased NOTCH2 transcript levels in primary keratinocytes and HaCaT cells, whereas a decrease was observed in SCL-1 cells. This observation suggests a disturbed UVB induced regulation of NOTCH2 transcription, which only exists at the stage of the complete malignant phenotype. In this work, we were able to characterize the effects of UVB radiation on photocarcinogenesis in more detail. Our results indicate an altered regulation of the transcription of genes of the p53 and notch pathway in primary, immortalized and transformed keratinocytes as a result of different UVB radiation doses and, in some cases, 1,25(OH)2D3 treatment. Dependent on the respective gene, these can be detected both at the level of initiated cells (HaCaT) and in cells with a completely malignant phenotype (SCL-1 cells). In addition, a 1,25(OH)2D3-associated reduction in TAp53 and NOTCH1 transcript levels can be observed in primary keratinocytes, which cannot be detected in this way in HaCaT and SCL-1 cells. With regards to the reduced TAp53 transcript levels in HaCaT cells irradiated with vitamin D-treated high-dose UVB, it could be discussed whether 1,25(OH)₂D₃- treatment in HaCaT cells might not even favor the third step of photocarcinogenesis (progression). The absence of this effect in SCL-1 cells may indicate that vitamin D-regulated transcription of TAp53 and NOTCH1 correlates with the presence of wild-type p53 protein. To what extent these differences are causal to different p53 functionality and to what extent these differences are involved in pathogenesis needs to be clarified by future studies.