Die Interaktion von mikrovaskulären Endothelzellen und adipösen Stammzellen in vitro vor dem Hintergrund der Weichgewebeheilung

Abstract

Die zunehmende Alterung der Gesellschaft führt weltweit zu einer steigenden Inzidenz chroni-scher Wunden und chronischer Weichgewebeschäden. Diese sind besonders häufig mit Er-krankungen wie chronisch venöser Insuffizienz, peripherer arterieller Verschlusskrankheit und Diabetes Mellitus sowie mit Immobilität assoziiert. Bei solchen chronischen Wunden bzw. Weichgewebeschäden läuft die Gewebeheilung gestört ab. Normalerweise heilt eine Wunde in 4 sich überlappenden Phasen ab, beginnend mit der Hämostase, der sich die Inflammations-phase anschließt. Diese geht in die Proliferationsphase über, welche schließlich in der Phase des Remodellings endet. Nicht heilende Wunden sind besonders durch eine verlängerte In-flammationsphase charakterisiert. Solche Wunden sind oftmals hypoxisch und es kommt zu einer gestörten bzw. verzögerten Angiogenese. Es existieren zahlreiche etablierte Behandlungskonzepte chronischer Wunden, welche jedoch nicht immer zu einer erfolgreichen Heilung führen. Aktuell werden, als neue Therapiemodalität chronischer Wunden, unter anderem zellbasierte Therapien erforscht. Hierfür eignen sich mitunter mesenchymale Stammzellen (MSC), da sie in verschiedene mesenchymale Zellen differenzieren können und über für die Wundheilung förderliche parakrine Eigenschaften ver-fügen. Zu diesen MSC gehört auch die adipöse Stammzelle (ADSC). Aufgrund ihrer guten Verfügbarkeit, der relativ einfachen Isolierung, der Fähigkeit, in einen myofibroblastoiden Zelltypen zu differenzieren und ihren besonderen antiinflammatorischen und angiogenen Eigenschaften werden ADSC in In-vitro-Versuchen, Tierversuchen, präklinischen und klini-schen Studien zur Verwendung für die Therapie chronischer Wunden und Weichgewebeschä-den untersucht. Mikrovaskuläre Endothelzellen sind für die Re-Etablierung der Sauerstoffversorgung des ge-schädigten Gewebes essentiell. Allerdings existieren bis dato wenige Arbeiten, die sich im Detail mit der direkten Interaktion zwischen adipösen Stammzellen und mikrovaskulären En-dothelzellen beschäftigen. Um die Interaktion beider Zelltypen im Rahmen der Weichgewe-bereparatur zu untersuchen, wurde der „Co-Culture Scratch Wound Migration Assay“ (CCSWMA) herangezogen. Auf der Basis des Assays wurden die Auswirkungen der Co-Kultivierung (CK) von humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) und ADSC auf die Parameter Proliferation (Zelldichte und Zellzyklusphase), Apoptose, Migration (Verschluss der In-vitro-Wunde), Differenzierung der adipösen Stammzelle zu einer myo-fibroblastoiden Zelle und Zytokinausschüttung (Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), Mono-cyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)) untersucht. Diese Parameter wurden sowohl unter dem Einfluss von Hypoxie als auch von Hypoxie gefolgt von Reoxygenierung erhoben und mit der jeweiligen normoxischen Kontrolle verglichen. Neben der Co-Kultivierung beider Zelltypen erfolgte auch die Anlage von Mono-Kulturen (MK), die analog kultiviert und ausgewertet wurden. Bezüglich der Proliferation wurden HDMEC durch die Präsenz von ADSC stärker beeinflusst als umgekehrt. Während HDMEC in MK unter normoxischen Bedingungen ihre Zelldichte im Zeitverlauf signifikant erhöhen konnten, war dies in CK mit ADSC nicht möglich. Auch in Bezug auf den Zellzyklus zeigte sich ein hemmender Effekt der ADSC auf HDMEC: Während der Anteil sich außerhalb der G0-Phase des Zellzyklus befindlicher, Ki-67/MIB-1-positiver HDMEC in MK zwischen 41-59% lag, lag er in CK zwischen 15-37%. ADSC zeigten sowohl in MK als auch in CK eine deutliche Erhöhung ihrer Zelldichte im Zeitverlauf unter normoxischen Bedin-gungen. Im Gegensatz zu HDMEC konnten ADSC in MK auch unter dem Einfluss von Hypoxie proliferieren, eine Erhöhung der Zelldichte nach Reoxygenierung war sowohl in CK als auch MK erkennbar. Bezüglich des Anteils Ki-67/MIB-1-positiver ADSC, der in MK und CK unter allen Bedingungen ähnlich war, lässt sich schließen, dass HDMEC die Proliferation von ADSC nicht beeinflussen. ADSC zeigten in MK und CK einen deutlich erhöhten Anteil apoptotischer Zellen nach Hypoxie bzw. folgender Reoxygenierung, während der Anteil apoptotischer HDMEC stets auf einem niedrigen Niveau blieb. HDMEC migrierten in MK unter normoxischen Bedingungen nur verzögert. In MK konnten ADSC sowohl unter Normoxie als auch nach Reoxygenierung signifikant migrieren, nicht je-doch unter hypoxischen Bedingungen. Allerdings kam es in CK bereits unter hypoxischen Bedingungen zu einer signifikanten Migration, welche in Bezug auf die In-vivo-Situation die Fähigkeit der ADSC darstellen könnte, in das sich bildende Granulationsgewebe zu migrieren. Die myofibroblastoide Differenzierung der ADSC war sowohl in MK als auch in CK anfangs am stärksten ausgeprägt. In MK kam es zu einer konstanten Abnahme unter Normoxie, während Hypoxie bzw. Reoxygenierung zu einer Erhöhung im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe führten. Dieses Verhalten war in CK nicht nachweisbar. Damit scheinen HDMEC die durch Hypoxie ausgelöste myofibroblastoide Differenzierung der ADSC eher zu hemmen. In Bezug auf die Freisetzung von IL-6 scheint die CK von ADSC und HDMEC zu einem An-stieg insbesondere unter hypoxischen Bedingungen und nach Reoxygenierung zu führen, welcher in diesem Ausmaß nicht in den beiden MK feststellbar war. HDMEC-MK zeigten die mit Abstand stärkste IL-8-Sekretion. Durch die CK mit ADSC kam es zu einer starken Dämp-fung der IL-8-Freisetzung, möglicherweise hemmen ADSC also die IL-8-Sekretion von HDMEC. Ebenso war die Konzentration von MCP-1 in HDMEC-MK im Vergleich zur ADSC-MK und CK am höchsten. Hier zeigte sich zunächst eine Reduktion der Freisetzung unter hypoxi-schen Bedingungen, gefolgt von einem späten Anstieg ohne Veränderung durch den Einfluss von Reoxygenierung. In ADSC-MK zeigten sich weitgehend konstante MCP-1-Werte. In CK zeigte sich erneut der Abfall der MCP-1-Freisetzung unter hypoxischen Bedingungen mit einem späten Anstieg ohne Auswirkung der unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen. Insge-samt zeigte sich in CK eine moderate MCP-1-Freisetzung, verglichen mit der HDMEC-MK, sodass auch hier die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf eine antiinflammatorische Wirkung der ADSC hinweist. In ADSC-MK zeigte sich ein Anstieg der Freisetzung von VEGF unter Hypoxie und nach Reoxygenierung. In CK konnte VEGF besonders unter dem Einfluss von Hypoxie bzw. Reoxygenierung nachgewiesen werden. Auf der Basis dieses Modells wird durch ADSC insgesamt ein angiogenes und antiinflammato-risches Milieu geschaffen, was insbesondere unter Hypoxie und Reoxygenierung deutlich wird und sich dort u.a. anhand der gehemmten Freisetzung von IL-8 und der vermehrten Freiset-zung von VEGF zeigt. Die Übertragung der Ergebnisse auf die humane Wundheilung und speziell auf chronische Wunden mit den dafür typischen hypoxischen Verhältnissen legt dem-nach eine Regulierung der HDMEC durch ADSC nahe. Ein daraus resultierendes angiogenes und antiinflammatorisches Milieu könnte die Wundheilung positiv beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Kultivierung beider Zelltypen auf der Basis des CCSWMA möglich ist und hierdurch Rückschlüsse auf die In-vivo-Situation der Wundheilung möglich sind. Eine Erweiterung des CCSWMA in späteren Arbeiten durch Hinzunahme von Auswertungsparametern ist in Abhängigkeit von der zu beantwortenden Fragestellung denkbar.

The constantly increasing age of the population is associated with an increase in the incidence of chronic wounds and chronic soft tissue lesions. Accompanying comorbidities are often chronic venous insufficiency, peripheral artery disease, diabetes mellitus and immobility. The wound healing cascade is disturbed in such chronic wounds. Normally, wound healing is ac-complished through 4 overlapping stages, the first being haemostasis, which is followed by the inflammatory phase. The latter passes into the proliferative phase, which is finalized by the remodelling phase. Non-healing wounds are usually characterized by a prolonged inflammato-ry phase. Furthermore, these wounds are often hypoxic and show impaired angiogenesis. There are many well-established treatment options for chronic wounds, which however some-times fail to promote wound healing. With respect to a new therapy option, research has re-cently focused on cell-based therapy. Mesenchymal stem cells (MSC) seem to fit well for this purpose, due to their differentiation potential into other mesenchymal cells and their paracrine properties, which are beneficial for the wound environment. Adipose derived stem cells (ADSC) belong to the group of MSC. Because of their good availability, the relatively easy isolation procedure, their ability to differentiate into a myofibroblastic cell type and their anti-inflammatory and angiogenic properties, ADSC are investigated in in-vitro-trials, animal stud-ies, preclinical and clinical trials with respect to the treatment of chronic wounds and soft tissue defects. Microvascular endothelial cells are essential for the reestablishment of oxygen supply within damaged tissues. However, there are only a few studies investigating the direct interaction of ADSC and human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) in detail. Therefore, the “Co-culture Scratch Wound Migration Assay” (CCSWMA) was used to study the interaction of both cell types against the background of soft tissue repair. Using this assay, the impact of co-culturing both cell types regarding the parameters proliferation (cell density and cell cycle phase), apoptosis, migration (closure of an in-vitro-wound), differentiation of ADSC into a myofibroblastic cell type and cytokine release (Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), mono-cyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and Vascular endothelial growth factor (VEGF)) were studied. Data were collected subsequent to hypoxic culture and hypoxia followed by reoxygen-ation and they were compared to the matching control groups undergoing normoxic culture. In addition to co-cultures (CK), mono-cultures (MK) of both cell types were also analyzed follow-ing the same culture and evaluation protocols. Regarding their proliferative capacities, HDMEC seemed to be more strongly influenced by the presence of ADSC, than vice versa. While HDMEC could significantly increase their cell num-ber during normoxic culture over time in MK, this was not the case in CK with ADSC. The dampening effect of ADSC on HDMEC proliferation was also visible during cell cycle analysis. While the rate of HDMEC out of the G0-phase, which stained positive for Ki-67/MIB-1 ranged between 41-59% in MK, the rate in CK ranged between 15-37%. ADSC were able to signifi-cantly increase their cell number both in MK and CK under normoxic conditions. In addition, ADSC showed a significant increase in cell number in MK under hypoxic conditions and after reoxygenation in MK and CK. Considering the rate of Ki-67/MIB-1-positive ADSC, which was similar in MK and CK under all conditions, it seems that HDMEC do not influence the prolifera-tion of ADSC. ADSC showed a higher rate of apoptotic cells after hypoxia and following reoxy-genation, both in MK and CK, while the rate of apoptotic HDMEC was always very low. HDMEC showed a delayed migration under normoxic conditions in MK. In MK, ADSC showed significant migration under normoxic conditions and after reoxygenation, while there was no significant migration under hypoxic conditions. However, a significant decrease in the width of the in-vitro-wound was noted in CK under hypoxic conditions. With respect to the in-vivo-situation, this points to the ability of ADSC to migrate into an emerging granulation tissue. Myofibroblastic differentiation of ADSC was strongest at the early point in time, both in MK and in CK. In MK, there was a constant decrease in the rate of differentiated ADSC under normoxic conditions, while hypoxia and reoxygenation, respectively, led to an increase, in comparison to the control group. This increase was not noted among ADSC in CK. HDMEC seem to inhibit myofibroblastic differentiation triggered by hypoxia. Regarding the release of IL-6, co-culturing ADSC and HDMEC seemed to cause an increase under hypoxic conditions and after reoxygenation, which was not present in both MK. IL-8-secretion was highest among HDMEC-MK. Co-culturing of HDMEC with ADSC led to a strong decrease of the IL-8-release, a dampening effect likely effected by ADSC. Similarly, HDMEC-MK showed the highest MCP-1-secretion when compared to ADSC-MK and CK. A reduction was noted under hypoxic conditions, followed by a late significant increase in the release of MCP-1, which was not affected by reoxygenation. ADSC-MK released a constant amount of MCP-1 under all conditions. In CK, a late increase of the MCP-1-secretion, which was not affected by reoxygenation, was noted. All in all, there was a moderate MCP-1-secretion in CK when compared to HDMEC-MK, which hints towards anti-inflammatory properties of ADSC. ADSC-MK showed a significant increase of the VEGF-release under hypoxia and after reoxy-genation. Primarily under these conditions, the release of VEGF was detectable in CK. Based on this model, ADSC create an angiogenic and anti-inflammatory milieu, which is more pronounced under hypoxia and reoxygenation by the decreased secretion of IL-8 and the increased release of VEGF. Applied to the in-vivo-situation of human wound healing and espe-cially chronic wounds with their hypoxic conditions, these results show a regulation of HDMEC through ADSC. A resulting angiogenic and anti-inflammatory milieu may positively affect wound healing. The results indicate that both cell types can be co-cultured using the CCSWMA, allowing for new insights into the in-vivo-situation of wound healing. Conclusions regarding wound healing can be drawn. In the future, the assay is expandable by adding further analytical parameters, depending on the questions to be answered.