Evaluation einer neuen Generation der Interferon-γ Release Assays in immunsupprimierten Patientengruppen

Abstract

Tuberkulose ist die zweittödlichste infektiöse Erkrankung und zählt zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat eine End TB Strategy entwickelt, in der bis 2035 die Sterberate an Tuberkulose um 35 % und die Inzidenzrate um 90 % im Vergleich zu 2015 gesenkt werden sollen. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen zahlreiche medizinische Weiterentwicklungen erfolgen, unter anderem im Bereich der Diagnostik. Bisher zählt der direkte Erregernachweis des Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) als Goldstandard in der Diagnostik einer aktiven Tuberkulose. Zum Nachweis einer latenten Tuberkuloseinfektion (LTBI) dienen indirekte Nachweisverfahren wie der Tuberkulinhauttest (TST) und der Interferon-Gamma Release Assay (IGRA). Testverfahren, die einerseits eine sichere Differenzierung zwischen einer LTBI und einer aktiven Tuberkuloseerkrankung erlauben und andererseits die Wahrscheinlichkeit der Progression einer LTBI zu einer aktiven Tuberkulose vorhersagen können, werden dringend benötigt, um die Therapiestrategien für Patienten zu optimieren. Eine neue Generation der IGRAs, der QuantiFERON-TB Gold Plus Test soll durch ein zusätzliches Röhrchen (TB-2) nicht nur CD4-T-Zellen, sondern auch CD8-T-Zellen zur Interferon-gamma- (IFN-γ) Produktion stimulieren. Die Differenz der Röhrchen würde demnach die CD8-T-Zellantwort repräsentieren. Diese wiederum soll einerseits als Surrogatmarker einer aktiven Tuberkulose beziehungsweise der Progression einer LTBI zu einer aktiven Tuberkulose dienen und andererseits die Sensitivität und Spezifität des Testverfahrens bei Patienten mit supprimierten CD4-T-Zellen steigern. Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluation des QuantiFERON-TB Gold Plus Tests in verschiedenen immunsupprimierten Probandengruppen hinsichtlich seiner Spezifität und Sensitivität, der Differenz der beiden Röhrchen sowie der Quantifizierung der reagierenden T-Zellen in der Durchflusszytometrie. Die dafür 448 eingeschlossenen Studienteilnehmer setzten sich aus 84 Kontrollen, elf Patienten mit aktiver Tuberkuloseerkrankung (aTB) und 353 immunsupprimierten Personen zusammen. Wir konnten zeigen, dass der QuantiFERON-TB Gold Plus Test mit einer Spezifität von 94,5 %, einer Sensitivität von 90,9 % sowie einer geringen Anzahl an unschlüssigen Befunden (1,11 %) ebenfalls bei immunsupprimierten Menschen als sicheres diagnostisches Mittel zum Nachweis einer LTBI angewendet werden kann. Beim Vergleich der Höhe der IFN-γ-Antworten aller als positiv getesteten Probanden ergaben sich in unseren Untersuchungen sowohl für das TB-1- (p=0,6174) als auch für das TB-2-Röhrchen (p=0,6654) keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollpersonen, aTB und den immunsupprimierten Probanden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die beiden Röhrchen sehr gut miteinander korrelierten (Korrelationsindex nach Spearman r=0,7443), ohne dass sich ein signifikanter Unterschied in der Differenz des TB-2- und TB-1-Röhrchens zwischen Patienten mit aktiver und latenter Tuberkulose nachweisen ließ (p=0,69). Anhand des Fragebogens konnte evaluiert werden, dass die Patienten mit LTBI, die eine erhöhte Differenz aufwiesen, nicht wissentlich einen kürzlichen Kontakt zu einem aTB hatten. Zudem zeigte das Follow-up keine Tuberkuloseentwicklung bei diesen Patienten. Zur quantitativen und qualitativen Differenzierung der reagierenden T-Zellen der beiden Röhrchen wurde zusätzlich eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Dort konnte bewiesen werden, dass einerseits vor allem die CD4-T-Zellen IFN-γ in beiden Röhrchen produzierten und dass sich andererseits in beiden Röhrchen die CD4- und CD8-T-Zellantworten nicht signifikant voneinander unterschieden (p>0,99). Beim Vergleich der reagierenden Zellen zwischen den Probandengruppen stellte sich weder für die CD4-T-Zellen noch für die CD8-T-Zellen im TB-1- (p=0,2430 und p=0,8185) und TB-2-Röhrchen (p=0,5646 und p=0,8985) eine signifikante Divergenz heraus. In der Durchflusszytometrie wurden neben der Stimulation mit den TB-1- und TB-2-Antigenen zusätzlich Stimulationen mit PPD, ESAT-6, CFP-10 und SEB/SEE durchgeführt. Interessanterweise zeigten lediglich die IFN-γ produzierenden CD8-T-Zellen auf den Stimulus ESAT-6 eine signifikante Unterscheidung in der Höhe der IFN-γ-Produktion zwischen aTB und gesunden Probanden (p=0,0117) und Personen mit LTBI (p=0,0037). Zusammenfassend lässt sich somit festhalten, dass sich der QuantiFERON-TB Gold Plus Test als diagnostisches Mittel zur Detektion einer LTBI ebenfalls bei immunsupprimierten Patienten eignet. Entgegen den Erwartungen stellte sich in unserem Patientenkollektiv keine erhöhte IFN-γ-Produktion durch CD8-T-Zellen im TB-2-Röhrchen bei aTB dar. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich die CD4- und CD8-T-Zellantwort in den beiden Röhrchen bei allen positiv getesteten Probanden in den verschiedenen Probandengruppen nicht signifikant voneinander unterschied. Daher lieferte die Differenz der Röhrchen keine Hinweise auf Unterschiede zwischen den Patientengruppen und keine darauf, welche Patienten ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer aktiven Tuberkulose hatten. Deshalb kann die Differenz nicht als Surrogatmarker einer aktiven Tuberkulose oder einer Progression von einer LTBI zu einer aktiven Tuberkulose genutzt werden. Die Hinzugabe von ESAT-6 Peptiden in ein weiteres Röhrchen könnte gegebenenfalls in Zukunft vorhersagen, welche Patienten mit LTBI ein erhöhtes Progressionsrisiko zu einer aktiven Tuberkuloseerkrankung haben und damit die Diagnostik und die Präventivtherapien revolutionieren.

Summary Tuberculosis is the second deadliest infectious disease and is one of the leading causes of death worldwide. The World Health Organization (WHO) has developed an End TB Strategy, which aims to reduce the mortality rate from tuberculosis by 35 % and the incidence rate by 90 % by 2035 compared to 2015. Achieving this goal will require numerous medical developments, including in the field of diagnostics. Until now, the direct detection of the pathogen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) has been the gold standard in the diagnosis of active tuberculosis. Indirect detection methods such as the tuberculin skin test (TST) and the interferon-gamma release assay (IGRA) are used to detect a latent tuberculosis infection (LTBI). Test procedures that allow a reliable differentiation between LTBI and active tuberculosis on the one hand and can predict the probability of progression from LTBI to active tuberculosis on the other hand are urgently needed in order to optimize treatment strategies for patients. A new generation of IGRAs, the QuantiFERON-TB Gold Plus Test, is designed to stimulate not only CD4-T-cells but also CD8-T-cells to produce interferon-gamma (IFN-γ) through an additional tube (TB-2). The difference between the tubes would therefore represent the CD8-T-cell-response. The CD8-T-cell-response is intended to serve as a surrogate marker of active tuberculosis or the progression of LTBI to active tuberculosis and to increase the sensitivity and specificity of the test procedure in patients with suppressed CD4-T-cells. The aim of this study was the evaluation of the QuantiFERON-TB Gold Plus Test in various immunosuppressed groups with regard to its specificity and sensitivity, the difference between the two tubes and the quantification of the reacting T-cells in flow cytometry. The 448 recruited study participants consisted of 84 controls, eleven patients with active tuberculosis (aTB) and 353 immunosuppressed individuals. We were able to show that the QuantiFERON-TB Gold Plus Test with a specificity of 94.5 %, a sensitivity of 90.9 % and a low number of indeterminate results (1.11 %) can also be used as a reliable diagnostic tool for the detection of LTBI in immunosuppressed people. When comparing the level of IFN-γ responses of all test subjects who tested positive, our study revealed no significant differences between control persons, aTB and the immunosuppressed subjects for the TB-1 (p=0,6174) and for the TB-2-tube (p=0,6654). Our results showed that the two tubes correlated very well with each other (Spearman’s correlation index r=0,7443). There was no evidence of statistical significancy in the difference between the TB-2-and TB-1-tubes in patients with active and latent tuberculosis (p=0,69). The questionnaire was used to evaluate that the patients with LTBI who showed an increased difference did not knowingly have recent contact with aTB. In addition, the follow-up showed no development of tuberculosis in these patients. For quantitative and qualitative differentiation of the reacting T-cells in both tubes, flow cytometry was also performed. This showed that, on the one hand, the CD4-T-cells in particular produced IFN-γ in both tubes and that, on the other hand, the CD4- and CD8-T-cell-responses in both tubes did not differ significantly from each other (p>0,99). When comparing the responding cells between the subject 10 groups, there was no significant divergence for either the CD4-T-cells or the CD8-T-cells in the TB-1- (p=0,2430 and p=0,8185) and TB-2-tube (p=0,5646 and p=0,8985). In flow cytometry, in addition to simulation with the TB-1 and TB-2 antigens, stimulations with PPD, ESAT-6, CFP-10 and SEB/SEE was also performed. Interestingly, only the IFN-γ producing CD8-T-cells on the stimulus ESAT-6 showed a significant difference in the level of IFN-γ production between aTB and healthy subjects (p=0,0117) and subjects with LTBI (p=0,0037). In summary, the QuantiFERON-TB Gold Plus test is also suitable as a diagnostic tool for the detection of LTBI in immunosuppressed patients. Contrary to expectations, there was no increased IFN-γ production by CD8-T-cells in the TB-2-tube in aTB in our patient collective. In addition, it could be shown that the CD4- and CD8-T-cell-response in the two tubes did not differ significantly from each other in all subjects tested positive in the different study groups. Therefore, the difference in the tubes provided no indication of differences between the patient groups and no indication of which patients had an increased risk of developing active tuberculosis. Therefore, the difference in the tubes cannot be used as a surrogate marker of active tuberculosis or progression from LTBI to active tuberculosis. The addition of ESAT-6 peptides to another tube could possibly predict in the future which patients with LTBI have an increased risk of progression to active tuberculosis. This would revolutionize diagnostics and preventive therapies.