Die Generierung und Analyse der angiogenen Aktivität von Sphäroiden aus mikrovaskulären Gefäßfragmenten (MVF)

Abstract

In den vergangenen Jahren hat sich die Prävaskularisierung von Gewebekonstrukten zu einem Themenschwerpunkt im Bereich Tissue Engineering entwickelt. Hierbei werden gegenwärtig verschiedene Ansätze wie die Stimulierung der Angiogenese mittels Wachstumsfaktoren oder die direkte Bildung von Blutgefäßen unter Verwendung von Endothelzellen verfolgt. Viele dieser Strategien fördern den Prozess der Vaskularisierung. Allerdings ist die Entstehung neuer Blutgefäße immer noch nicht schnell genug, um eine ausreichende Versorgung der Gewebekonstrukte mit Sauerstoff und Nährstoffen in der frühen Post-Transplantationsphase zu gewährleisten. Ein vielversprechender Ansatz, der die Vaskularisierung beschleunigen könnte, wäre nicht die Induktion angiogener Prozesse, sondern die direkte Inkorporation kleiner Blutgefäße in das Gewebekonstrukt. Diese müssten dann nur noch untereinander und an dem Gefäßsystem des Empfängers Anschluss finden. In der Tat haben mehrere Studien der letzten Jahre gezeigt, dass sogenannte mikrovaskuläre Gefäßfragmente (microvascular fragments, MVF), welche enzymatisch aus dem Fettgewebe isoliert werden können, nicht nur ein hohes angiogenes Potential besitzen, sondern auch effektiv die Vaskularisierung von verschiedenen Gewebekonstrukten fördern. Da die MVF nach Isolierung in Lösung vorliegen und ohne Trägermatrix nicht adäquat transplantiert werden können, werden in der vorliegenden Arbeit erstmals Sphäroide aus MVF generiert, welche dann als transferierbare und hoch angiogene Vaskularisierungseinheiten im Bereich des Tissue Engineering eingesetzt werden könnten. Hierfür wurden MVF aus dem Nebenhodenfettgewebe von männlichen C57BL/6N-Mäusen isoliert und daraus mithilfe der Liquid-Overlay Technik über einen Kultivierungszeitraum von fünf Tagen Sphäroide generiert. Als Kontrolle dienten Sphäroide aus Zellen der stromalen Gefäßfraktion (stromal vascular fraction, SVF). Sowohl SVF- als auch MVF-Sphäroide zeigten eine sphäroidale Morphologie und die Zellen auf der Oberfläche waren locker organisiert. Beide Versuchsgruppen wiesen eine vergleichbare Viabilität auf. Allerdings enthielten MVF-Sphäroide einen signifikant höheren Anteil CD31-positiver Endothelzellen sowie α-smooth-muscle-actin(α-SMA)-positiver, gefäßwandstabilisierender Muskelzellen, was zu einer höheren angiogenen Sprossungsaktivität führte. Weiterführend zeigten MVF-Sphäroide auch eine im Vergleich zu SVF-Sphäroiden verbesserte in vivo-Vaskularisierung nach Transplantation auf den quergestreiften Rückenhautmuskel der Maus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass das Vaskularisierungspotential von MVF-Sphäroiden dem von SVF-Sphäroiden überlegen ist und dass sie somit potente Vaskularisierungseinheiten für Tissue Engineering-Anwendungen darstellen.

In recent years, the prevascularization of tissue constructs has become a major topic in the field of tissue engineering. Various approaches are currently being pursued, such as the stimulation of angiogenesis using growth factors or the direct formation of blood vessels using endothelial cells. Although many of these strategies promote the process of vascularization, the formation of new blood vessels is still not fast enough to ensure an adequate supply of oxygen and nutrients to the tissue constructs in the early post-transplantation period. A promising approach that could accelerate vascularization may not be the induction of angiogenic processes, but the direct incorporation of small blood vessels into the tissue construct. Then, they only need to connect to each other and to the recipient's vasculature. Several studies in recent years have shown that so-called microvascular fragments (MVF) which can be isolated enzymatically from adipose tissue not only have a high angiogenic potential but also effectively promote vascularization of various tissue constructs. Since MVF are in solution after isolation and cannot be adequately transplanted without a carrier matrix, the present work aims, for the first time, to generate spheroids from MVF, which can then be used as transferable and highly angiogenic vascularization units in the field of tissue engineering. For this purpose, MVF were isolated from epididymal fat tissue of male C57BL/6N mice. Spheroids were generated using the liquid overlay technique over a cultivation period of five days. Spheroids from the stromal vascular fraction (SVF) served as controls. SVF- and MVF- spheroids showed spheroidal morphology and the cells on the surface were loosely organized. Both experimental groups exhibited comparable viability. MVF-spheroids contained a significantly higher proportion of CD31-positive endothelial cells and α-smooth-muscle-actin(α-SMA)-positive stabilizing muscle cells, resulting in higher angiogenic sprouting activity. Further, compared with SVF-spheroids, MVF-spheroids also showed an enhanced in vivo-vascularization after grafting onto mouse striated muscle of the dorsal skinfold. The results of the present work suggest that the vascularization potential of MVF-spheroids is superior to that of SVF-spheroids and that they may represent potent vascularization units for tissue engineering applications.