IgA-Antikörper in der Tumortherapie : Funktionelle Evaluation polymerer Isoformen

Abstract

Humane IgA-Antikörper aktivieren Granulozyten für die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) von Tumorzellen effektiver als die bisher in der Tumortherapie zugelassenen Antikörper vom IgG-Isotyp. Durch Modifikationen der IgA-Antikörper konnte in vorangegangen Studien eine Verbesserung biochemischer und funktioneller Eigenschaften erzielt werden und letztlich ein optimierter IgA2m(1)-Antikörper produziert werden, der eine signifikant verbesserte Pharmakokinetik und Therapieeffektivität in vivo aufwies. Dieser monomere, gegen den Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor (EGFR) gerichtete und als IgA2.0 bezeichnete Antikörper war Ausgangspunkt dieser Arbeit. Für die Analyse der IgA-abhängigen granulozytenvermittelten Zytotoxizität wurde zunächst eine markierungsfreie, impedanzbasierte Echtzeit-Messung an adhärent wachsenden Tumorzellen etabliert. Kurzzeitmessungen bestätigten die Ergebnisse aus bisherigen Freisetzungstests, bekräftigten die Korrelation der Effektivität mit der EGFR-Expression auf der Oberfläche der Zielzellen und unterstützten zudem Trogoptose als zugrundeliegenden Mechanismus der Zytotoxizität der Granulozyten gegenüber den Tumorzellen. Die neue Möglichkeit der Langzeitmessung ergab tumorzelllinienspezifische Kinetiken und ließ auf eine Erschöpfung der Granulozyten schließen, mit der Konsequenz eines Wiederauswachses der nicht vollständig abgetöteten Tumorzellen. Der in dieser Arbeit hergestellte IgA-Antikörper mit der Bezeichnung IgA3.0, stellt eine Weiterentwicklung des IgA2.0 dar. Dabei zeigte IgA3.0 eine effektive Dimerisierung mittels der J-Chain und erwies sich durch die kovalente Verbindung der schweren und leichten Ketten als stabiler gegenüber dem IgA2-Wildtyp. Funktionelle Experimente konnten verbesserte Fab-vermittelte Funktionen, wie die Wachstumsinhibition von Tumorzellen, sowie eine verbesserte FcαRI-Bindung im Vergleich zum IgA2.0 nachweisen. Entgegen früherer Studien, die eine Überlegenheit der dimeren gegenüber den jeweiligen monomeren IgA-Antikörpern zeigten, übertrug sich die verbesserte Rezeptorbindung des IgA3.0 nicht auf die Funktionalität im ADCC-Assay. Im impedanzbasierten ADCC-Assay wurde eine verminderte Effektivität im Vergleich zum IgA2.0 gegenüber den untersuchten HPV- Kopf-Hals-Tumorzelllinien beobachtet. Interessanterweise zeigte sich das optimierte Dimer bei den HPV+ Kopf-Hals-Tumorzelllinien den anderen Dimeren überlegen und ähnlich effektiv wie das IgA2.0-Monomer. Der Überstand der HPV+ Zelllinien enthielt signifikant mehr sCD147 (soluble, lösliches CD147) und induzierte deutlich geringere Mengen an mCD147 (membranständiges CD147) auf den Granulozyten. Die mCD147 Dichte auf den Granulozyten korreliert mit der ADCC-Effektivität und eignet sich als prädiktiver Marker für die IgA-abhängige ADCC. Die Zugabe von sCD147 steigerte die ADCC-Effektivität des IgA3.0 dosisabhängig. Die Färbung von Gewebemikroarrays von Peniskarzinompatienten, einer weiteren HPV-assoziierten Tumorentität, zeigte eine gesteigerte CD147-Expression im Tumorzentrum und identifizierte auf diese Weise im Zusammenhang mit myeloischem Infiltrat HPV+ Patienten mit einem erhöhten Metastasierungspotential. Die Anwendung der optimierten IgA-Antikörper im ADCC-Assay an adhärenten Tumorzelllinien ergab, dass auch Tumorpatienten mit infiltrierenden Neutrophilen und einem Markerprofil, welches mit einer schlechten Prognose einhergeht (hohe EGFR-Expression, hohe CD147-Expression), in Zukunft vermutlich von einer IgA-Antikörperbasierten Immuntherapie profitieren könnten.

Human IgA antibodies engage granulocytes for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of tumor cells more effectively than the antibodies of the IgG isotype so far approved for tumor therapy. In previous studies, engineering of the IgA antibodies has improved their biochemical and functional properties. This led to the development of an optimized IgA2m(1) antibody with significantly enhanced pharmacokinetics and therapeutic efficacy in vivo. This monomeric IgA targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR), designated IgA2.0, served as the starting point of this work. A label-free, impedance-based real-time measurement for the analysis of IgA-dependent granulocyte-mediated cytotoxicity was established, that uses adherently growing tumor cells. Short-term measurements confirmed the results from previous release assays and reaffirmed the correlation of efficacy with EGFR surface expression on the target cells, while supporting trogoptosis as the underlying mechanism of granulocyte cytotoxicity towards tumor cells. The possibility of long-term measurement revealed tumor cell line-specific kinetics and suggested that granulocytes were exhausted, which resulted in the regrowth of tumor cells that had not been eliminated due to insufficient ADCC. The IgA antibody produced in this work designated IgA3.0, represents a further development of IgA2.0. It showed effective dimerization utilizing the J-chain and proved to be more stable than the IgA2 wildtype due to the covalent connection of the heavy and light chains. Functional experiments demonstrated improved fab-mediated functions, such as growth inhibition of tumor cells, and enhanced FcαRI binding compared to IgA2.0. However, contrary to previous studies that demonstrated superiority of the dimeric variants compared to the respective monomeric IgA antibodies, the improved receptor binding of IgA3.0 did not translate into efficacy of the ADCC-assay. In impedance-based ADCC assays IgA3.0 showed reduced effectiveness against the investigated HPV- head and neck tumor cell lines compared to IgA2.0. Interestingly the optimized dimer outperformed the other dimers against the HPV+ head and neck tumor cell lines and was found to be similarly effective as the IgA2.0 monomer. The supernatant of the HPV+ cell lines contained significantly more sCD147 (soluble) and induced notably lower amounts of mCD147 (membranous) on the granulocytes. The mCD147 density on the granulocytes correlated with ADCC efficacy and is suitable as a predictive marker for IgA-dependent ADCC. Addition of sCD147 increased the ADCC efficacy of the IgA3.0 in a dose-dependent manner. Staining of tissue microarrays from penile cancer patients, another HPV-associated tumor entity, revealed increased CD147 expression in the tumor center and marked, in association with myeloid infiltrate, HPV+ patients with higher metastatic potential. Using optimized IgA antibodies in the ADCC-assay on adherently growing tumor cell lines showed that tumor patients with infiltrating neutrophils and a marker profile associated with poor prognosis (high EGFR expression, high CD147 expression) could potentially benefit from IgA antibody-based immunotherapy in future.