Crosslinking (CXL), Autologous Serum (AS), Amniotic Membrane Suspension (AMS) and Amniotic Membrane Hom ogenate (AMH): Promising Tools t o Improve Corneal Epithelial Wound Healing?

Abstract

SUMMARY Crosslinking (CXL), Autologous Serum (AS), Amniotic Membrane Suspension (AMS) and Amniotic Membrane Homo genate (AMH): Promising Tools to Improve Corneal Wound Healing? Background and Purposes: Migration and proliferation of corneal epithelial cells are one of the most fundamental processes during corneal wound healing. Corneal limbal stem cells keep proliferating, differentiating and centripetally migrating to renew the epithelium. CXL, AS and amniotic membrane extract have been reported to support corneal epithelialization and wound healing and contain several growth factors. The purpos es of our stud ies w ere  To evaluate the effect of keratocyte supernatant after CXL (harvesting time, riboflavin concentration and UV A light illumination) on migration and proliferation of human corneal epithelial cells (HCECs) in vitro.  To study and compare the dose dependent effects of AS and FBS on HCEC migration, proliferation and viability in vitro, and to determine the concentrations and effects of KGF, FGFb, HGF and TGF β1 in AS.  To analyze the effects of different concentrations of AMS and AMH on HCEC viability, migration and proliferation in vitro, and to determine the concentrations and the influence of KGF, FGFb, HGF and TGF β1 concentration in AMS and AMH Me thods:  Primary human keratocytes isolated from 8 normal and 6 keratoconus corneas were cultured. Thereafter, keratocytes in 0%, 0.05% or 1% riboflavin solution were split into samples without and with 370 nm UVA light illumination. After removal of the ri boflavin solution, keratocytes were incubated in the mentioned keratocyte culture medium at 37 °C and keratocyte supernatant was harvested after 5 and 24 hours, respectively. Keratocyte supernatant without riboflavin and UVA treatment, was used as control. HCECs were cultured in DMEM/F12 with 5% FBS, 0.5% DMSO, 10 ng/mL human epidermal growth factor, 1% insulin transferrin selenium, until reaching confluence, the HCEC culture medium was replaced by the keratocyte supernatant and HCEC migration was analyzed using wound healing assay. HCEC proliferation was determined by the cell proliferation ELISA BrdU (colorimetric) kit. Statistical analysis was performed using a linear mixed model in the framework of a Generalized Estimating Equations (GEE) approach to ana lyze the effect of harvesting time, riboflavin concentration and UVA light illumination.  AS was prepared from 13 patients according to the regulations of the LIONS Cornea Bank Saar Lor Lux, Trier/Westpfalz. HCECs were firstly cultured as describe d above, t hen were incubated in serum media which was consisting of DMEM/F12 supplemented by 5%, 10%, 15% or 30% AS or FBS for 24 hours. Thereafter, HCEC viability was analyzed using Cell Proliferation Kit XTT, HCEC migration and proliferation was analyzed as descri be d above. KGF, FGFb , HGF and TGF β1 in AS was measured by ELISA. Statistical analysis was performed using generalized linear models to analyze the effect of AS and FBS, and to analyze the responses of HCEC viability, migration and proliferation to concentrations of KGF, FGFb , HGF, TGF β1 in AS  Amniotic membranes of 13 placentas were prepared and thereafter stored at 80°C using the standard methods of the LIONS Cornea Bank Saar Lor Lux, Trier/Westpfalz. For AMS preparation, following defreezing, AM pieces were inserted in a 6 well plate and 5 ml DMEM/F12 (with 5% FBS) per gram tissue was added for 96 hours of incubation. After removal of the amniotic membrane, the remaining supernatant was collected for experiments. For AMH preparation, following defreezing, amniotic membrane s were first homogenized in liquid nitrogen. After liquid nitrogen evaporated, 5 ml DMEM/F12 (with 5% FBS) per gram tissue was added. Following centrifugation (1000 rpm for 5 min), the supernatant was collected for experiments. HCECs were firstly cultured as describe d above, then were incubated in culture medium using DMEM/F12, 5% FBS supplemented by 15%, 30% or 100% AMS or 15% or 30% AMH. Thereafter, HCEC viability, migration and proliferation were analyzed as describe d above. KGF, FGFb, HGF and TGF β1 in AS and AMH were measured by ELISA. Comparison to the control group was performed using Mann Whitney U test, generalized linear model was used to analyze the responses of HCEC viability, migration and proliferation to concentrations of KGF, FGFb, HGF, TGF β 1. Results  Riboflavin concentration, UVA light illumination and harvesting time of normal or keratoconus keratocyte supernatant had no significant impact on HCEC proliferation ( P 0.10). Riboflavin concentration did no show significant impact on HCEC mig ration using normal or keratoconus keratocyte supernatant ( P 0.10). H owever, longer harvesting time of normal or keratoconus keratocyte supernatant significantly increased ( P 0.01 for both) and UVA light illumination of keratoconus keratocyte supernata nt ( P 0.001) significant l y decreased HCEC migration.  HCEC viability was the highest at 30% AS or 15% FBS and the lowest at 10% AS or 30% FBS application. HCEC migration was the quickest through 30% AS or 30% FBS and the slowest through 5% AS or 5% FBS co ncentrations. Proliferation was the most increased through 15% AS or 5% FBS and the least increased through 30% AS or 30% FBS concentrations. HCEC viability at 10% and 15% AS was significantly worse ( P = 0.001, P = 0.023) compared to baseline and significa ntly better at 15% FBS ( P = 0.003) concentrations. HCEC migration was significantly worse ( P ≤ 0.007) and HCEC proliferation significantly better P < 0.001) in all concentration groups compared to baseline.  HCEC viability remained unchanged using 15% or 30% AMS ( P = 1.0 for both), however, it decreased significantly using 100% AMS ( P < 0.001) or 15% P = 0.041) or 30% AMH ( P < 0.001), compared to controls . Using 15% or 30% AMS, HCEC migration increased significantly ( P < 0.001 for both). Using 15% or 30% AMH ( P = 0.153; P = 0.083), HCEC migration remained unchanged and 100% AMS inhibited HCEC migration ( P < 0.001). 15% and 30% AMS had no effect on HCEC proliferation ( P = 0.454 and P = 0.119), but 100% AMS P < 0.001) and 15% P = 0.002) and 30% AMH ( P = 001) inhibited HCEC proliferation significantly. Conclusions  Harvesting time, riboflavin concentration and UVA light illumination of normal and keratoconus keratocyte cultures has no impact on proliferation of HCECs, in the short term. However, 24 hours harvesting time (both for normal and keratoconus keratocytes) increases and UVA light illumination of keratoconus SUMMARY XIV keratocyte cultures decreases HCEC migration. keratocyte cultures decreases HCEC migration.  HCEC viability is mostly increased through 30% AS or 15% FBS, migration HCEC viability is mostly increased through 30% AS or 15% FBS, migration through 30% AS or 30% FBthrough 30% AS or 30% FBS and proliferation through 15% AS or 5% FBS. In S and proliferation through 15% AS or 5% FBS. In addition, AS better supports HCECs viability and migration than FBS.addition, AS better supports HCECs viability and migration than FBS.  With uWith unchanged HCEC viability and proliferation and increased HCEC migration, nchanged HCEC viability and proliferation and increased HCEC migration, 15% and 30% AMS application seems to be the most appropriate15% and 30% AMS application seems to be the most appropriate method to support method to support epithelial healing.epithelial healing.

Crosslinking (CXL), autologes Serum (AS), Amnionmembran S uspension (AMS) und Amnionmembran Homogenat (AMH): Vielversprechende Wekzeuge zur Verbesserung der Wundheilung des Hornhautepithels? Hintergrund / Ziele: Die Migration und Proliferation spielt eine entscheidende Rolle in der kornealen Wundheilung. Korneale limbale Stammzellen sorgen für e ine ständige Erneuerung des Epithels durch Proliferation, Differenzierung und Migration. CXL, AS und Amnionmembran enthalten verschiedene Wachstumsfaktoren, die die Wundheilung des kornealen Epithels unterstützen. Die Ziel e dieser Studie war en  Den Effekt von Zellkulturüberständen von Keratozyten nach CXL (Abnahmezeitpunkt, Riboflavin-Konzentration und UVA-Licht Einfluss) hinsichtlich der Migration und Proliferation humaner kornealer Epithelzelllinien (HCEC) in vitro zu untersuchen.  Der Vergleich Dosis-abhängiger Effekte von AS und FBS auf die Migration, Proliferation und Viabilität von HCEC’s in vitro, sowie die Bestimmung der Konzentrationen und Effekte von KGF, FGFb, HGF und TGF-β1 im autologen Serum.  Den Effekt unterschiedlicher Konzentrationen von AMS und AMH auf die Migration und Proliferation von HCEC’s in vitro, sowie die Bestimmung der Konzentration und Effekte von KGF, FGFb, HGF und TGF-β1 Konzentration in AMS und AMH. Methoden:  Primäre humane Keratozyten wurden von 8 gesunden und von 6 Patienten m it diagnostiziertem Keratokonus isoliert und kultiviert. Die Keratozyten wurden mit einer Riboflavin Lösung der Konzentrationen 0%, 0,05% und 0,1% versehen. Eine Gruppe wurde mit einer Wellenlänge von 370 nm UVA Licht bestrahlt, eine Gruppe blieb unbestrah lt. Nach der Bestrahlung wurde die Riboflavin Lösung entfernt und durch Kulturmedium ersetzt. Nach jeweils 5 Stunden und 24 Stunden Inkubation wurde das Kulturmedium entnommen. Als Kontrolle dienten Kulturüberstände ohne Riboflavin und ohne Bestrahlung. HC EC’s wurden in DMEM/F12 supplementiert mit 5% FBS, 0 5% DMSO, 10 ng/mL humanem Epidermal Growth Factor, 1% Insulin Transferrin Selenium bis zur Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde gegen die Zellkulturüberstände der Keratozytenkulturen ersetzt. Die Migra tion wurde mit einem Scratch Assay analysiert, die Bestimmung der Proliferation erfolgte kolorimetrisch. Die statistische Auswertung erfolgte mit einem linearen generalisierten Modell (GEE), um die Einflussgrößen der Inkubationszeit, der Riboflavin Konzent ration und des UVA Lichts unabhängig voneinander zu bestimmen.  Das autologe Serum von 13 Patienten wurde nach den Richtlinien der LIONS Hornhaut Bank Saar Lor Lux, Trier/Westpfalz präpariert. HCEC’s wurden wie beschrieben kultiviert und für 24 Stunden mit DMEM/F12 supplementiert entweder mit 5%, 10%, 15% und 30% AS oder FBS inkubiert. Die Viabilität der HCEC’s wurde mit einem XTT Zellproliferations Test Kit kolorimetrisch erfasst. Die Migration und Proliferation wurden wie bereits beschrieben analysiert. D ie Konzentration von KGF, FGFb, HGF und TGF β1 in AS wurde mit einem ELISA gemessen. Die Statistische Analyse erfolgte mit einem linearen generalisiertem Modell um den Einfluss von AS und FBS auf die Viabilität, Migration und Proliferation in Abhängigkeit von KGF, FGFb, HGF, TGF β1 in AS zu erfassen.  Amnionmembranen von 13 Patientinnen wurden nach den Richtlinien der LIONS Hornhautbank Saar Lor Lux, Trier/Westpfalz präpariert und bei 80°C tiefgefroren. Für die Präparation der AMS wurden die Membranen in kl eine Stücke geschnitten und mit 5ml DMEM/F12 (+ 5% FBS) pro Gramm Gewebe für 96 Stunden inkubiert. Das Medium ohne Amnionmembran wurde für die Testansätze verwendet. Für die Präparation des AMH wurden die Membranen in flüssigem Stickstoff homogenisiert und das Homogenat in 5ml DMEM/F12 (+ 5% FBS) pro Gramm Gewebe aufgenommen. Für die Experimente wurde der Überstand des Homogenates verwendet. Die HCEC’s wurden wie schon beschrieben kultiviert und mit DMEM/F12, 5% FBS und jeweils 15%, 30% oder 100% AMS, oder 15% oder 30% AMH inkubiert und die Migraton und Proliferation bestimmt. Die Messung der Konzentrationen von KGF, FGFb, HGF and TGF β 1 in AMS und AMH erfolgte mit einem ELISA.Die Vergleiche zu den Kontrollgruppen wurden mit dem Mann Whitney U Test analysier t, ein lineares generalisiertes Model diente zur Erfassung der Einfluss von KGF, FGFb, HGF, TGF β 1 auf die Migration und Proliferation der HCEC’s. Ergebnisse:  Die Riboflavin Konzentration, UVA Bestrahlung und Abnahmezeit des Mediums von normalen oder Kera tokonus Keratozyten zeigen keinen Einfluss auf die Proliferation der HCEC’s ( P 0,1). Die Riboflavin Konzentration im Medium von normalem oder Keratokonus Keratozyten hatte keinen Einfluss auf die Migration der HCEC’s ( P 0,1), eine spätere Abnahme Zeit des Mediums von normalen und Keratokonus Keratozyten erhöhte die Migrationsrate der HCEC‘s ( P 0,01). Die Bestrahlung der Keratokonus Keratozyten mit UVA Licht hingegen verlangsamte die Migration der HCEC’s ( P 0,001).  Die Viabilität der HCEC’s zeigte d ie höchsten Werte bei dem Einsatz von 30% AS und 15% FBS, die niedrigsten Werte bei 10% AS und 30% FBS. Die Migrationsrate war bei Verwendung von 30% AS und 30% FBS am höchsten und zeigte bei 15% AS und 5% FBS die geringsten Migrationsraten. Die Proliferat ionsrate war bei einem Einsatz von 15% AS und 5% FBS am höchsten und zeigte unter Verwendung von 30% AS und 30% FBS die geringsten Proliferationsraten. Die Viabilität der HCEC’s zeigte die schlechtesten Werte bei Verwendung von 10% und 15% AS ( P 0,001, P 0,023) im Vergleich zur Basislinie und die besten Werte bei Einsatz von 15% FBS ( P 0,003). Die Migration der HCEC’s zeigte in allen Gruppen signifikant schlechtere Werte ( P 0,007), die Proliferation hingegen signifikant bessere Werte ( P 0,001) im Vergleich zur Basislinie.  Die Viabilität der HCEC’s zeigte keine Veränderung bei Verwendung von 15% und 3 0 % AMS (beide P 1,0). Eine signifikant schlechtere Viabilität zeigt sich unter Verwendung von 100% AMS ( P 0,001) und 15% bzw. 30% AMH ( P 0,001), im Vergleich zur Kontrolle. Bei Einsatz von 15% und 30% AMS steigt die Migrationsrate der HCEC’s signifikant an ( P 0,001 für beide). Die Migration zeigt keinen Unterschied bei Einsatz von 15% und 30% AMH ( P 0,153, P 0,083), zeigt jedoch eine erniedri gte Migrationsrate bei Einsatz von 100% AMS ( P 0,001). Auf die Proliferation der HCEC’s zeigt der Einsatz von 15% und 30% AMS keinen Effekt ( P 0,454, P 0,119), wird jedoch bei Verwendung von 100% AMS ( P 0,001) und 15% und 30% AMH ( P 0,002, P 0,001) signifikant inhibiert. Zusammenfassung:  Der Abnahmezeitpunkt des Mediums bei normalen und Keratokonus Keratozyten, Riboflavin konzentration und UVA Licht haben keinen Einfluss auf die Proliferation von HCEC’s. Eine Abnahme des Mediums nach 24 Stund en von normalen und Keratokonus Keratozyten steigert jedoch die Migrationsrate, während der Einsatz von UVA Licht die Migrationsrate der HCEC’s hemmt.  Die Viabilität der HCEC’s ist am höchsten unter Verwendung von 30% AS und 15% FBS, die Migrationsrate bei Einsatz von 30% AS und 30% FBS und die Proliferation bei Verwendung von 15% AS und 5% FBS.  Betrachtet man die unveränderte Viabilität und Proliferation der HCEC’s bei erhöhter Migrationsrate, zeigt die Verwendung von 15% und 30% AMS das beste Resultat um die epitheliale Wundheilung zu unterstützen.