Evaluation der Wertigkeit der Raman-Spektroskopie in Bezug auf Fixations-Methoden sowie die Unterscheidung verschiedener Tumoren des menschlichen Nervensystems

Abstract

In diesem Manuskript wird eine neue Methode, basierend auf der Raman Spektroskopie, zur Diagnostik von Hirntumoren vorgestellt. Bei der Raman Spektroskopie werden die zu untersuchenden Gewebe mit einem Laser bestrahlt und das eingehende Licht wird dann zu einem kleinen Teil in einer veränderten Wellenlänge reflektiert. Dies wird als Ramaneffekt bezeichnet und ermöglicht einen genauen Rückschluss auf die biochemische Gewebeentität. Durch dieses spektroskopische Verfahren entsteht die Möglichkeit eine neue gewebserhaltende Untersuchungsmethode für den Neurochirurgen/Neuropathologen verifizieren zu können. Mithilfe von maschinellem Lernen soll ein SVM-Klassifier (Support vector machine Klassifier) trainiert werden, um möglichst schnell und unkompliziert verschiedene Gewebetypen unterscheiden zu können. Ein besonderes Merkmal wurde hierbei auf die Analyse und Differenzierung von fixiertem Gewebe gelegt. Es werden native Gewebeproben direkt nach der Entnahme aus dem Operationssitus verwendet und mit Hilfe eines speziellen Raman Spektroskops analysiert. Dabei wird immer ein visible light image (VLI) der Probe sowie der gesetzten Messpunkte festgehalten, was eine retrospektive Zuordnung jedes einzelnen Spektrums zu einem bestimmten Punkt erlaubt. Anschließend wird die Gewebeprobe von einem Neuropathologen interpretiert. Für die Fixierungsanalysen werden die Proben einmal im nativen Zustand gemessen und dann durch Trockeneis kryofixiert und/oder durch eine 4%-ige Formalin-Mischung haltbar gemacht. Auch diese Proben werden wiederrum von einem Neuropathologen untersucht. Für die Fixierung wurde in dieser Arbeit zunächst festgehalten, dass die Kryofixierung mit Trockeneis die Raman-Spektra nicht wesentlich beeinflusst. Daraus folgt die Möglichkeit Klassifier, die auf native Daten trainiert wurden, zur Analyse von kryofixierten Gewebeproben zu nutzen. Somit könnte die Raman Spektroskopie verwendet werden, um bereits bestehende Tumor-Banken zu explorieren ohne die wertvollen Proben zu zerstören. Auf der anderen Seite bringt die Formalin-Fixierung größere Änderungen auf biochemischer Ebene mit sich. Das macht die Handhabung Formalin-fixierter Proben schwieriger. Die Klassifier-Ergebnisse konnten durch Differenzbildung zwischen dem reinen Formalin-Spektrum und dem Spektrum der Formalin-fixierten Daten verbessert werden. Ein zweiter Punkt dieser Studie basiert auf der Differenzierung von Dura mater und Meningeomen. Dieser wird zuerst in der Unterscheidung der verschiedenen Raman-Spektren und anhand der klar differenzierbaren TSNE-Plots (T-distributed Stochastic Neighbor Embedding Plots) festgestellt. Nach einigen weiteren Analysen kann dann festgestellt werden, dass diese Abweichung zu einem gewissen Anteil durch den ungleichen Kollagengehalt sowie die variierende Lipid-Zusammensetzung dieser beiden Gewebstypen zustande kommt. Zuletzt wird ein SVM-Klassifier mit den vorliegenden Daten trainiert. Mit diesen Ergebnissen kann eine virtuelle Einfärbung (heat map) des Probenbildes realisiert werden. Dabei wird eine Art Filter über das Bild gelegt, welcher Meningeom-enthaltende sowie Nicht-Meningeom-enthaltende Bereiche in unterschiedlichen Farben kennzeichnet. Dies könnte dem Neurochirurgen erlauben, Rückschlüsse auf den Gewebeursprung mit einer Sensitivität von 93,0% und einer Spezifität von 89,7% zu ziehen. Die Resultate konnten auf histologischer Ebene verifiziert werden. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass sich diese neue gewebserhaltende und schnelle Methode für die intraoperative Gewebe-Diagnostik sowie die retrospektive Analyse von bereits fixierten Proben eignet. Die Raman-Spektroskopie könnte den klinischen Alltag als schnell durchführbares und einfaches diagnostisches Verfahren bereichern. Weitere und tiefgreifende Studien an weiteren Gewebeentitäten sollten mit der Raman Spektroskopie vorgenommen werden, um einen noch besseren Einblick in das mögliche Potential der Raman Spektroskopie zu erhalten. Die Ergebnisse der Fixierungs-Analyse, also die Möglichkeit einen auf native Daten trainierten Klassifier auf kryofixierten Daten anzuwenden, eröffnet die Möglichkeit zur Exploration von Tumor-Banken. Hierbei könnten auf schnelle Art und Weise sehr viele Daten, auch Daten bezüglich seltener Tumoren gesammelt werden, was wiederrum die Präzision und Genauigkeit der trainierten Klassifier erhöhen könnte. Ausblickend könnte außerdem ein sogenannter Omniclass-Klassifier trainiert werden, ein Klassifier der zwischen allen möglichen Gewebearten unterscheiden könnte. An der Weiterentwicklung dieses Verfahrens wird gearbeitet, zusätzliche Tumorentitäten werden untersucht und Ziel ist es, das Verfahren in das Operationsmikroskop des Neurochirurgen zu integrieren. Dies könnte bereits intraoperativ ein direktes Feedback über das eventuell zu resezierende Gewebe geben.

This manuscript introduces a new method, based on Raman spectroscopy, for the diagnosis of brain tumors. In the field of Raman spectroscopy, the tissues are irradiated with a laser and the incoming light is afterwards reflected to a small extent in a modified wavelength. This is called the Raman effect and allows accurate conclusion of the biochemical tissue entity. This spectroscopic technique creates the possibility of verifying a new, potentially powerful, and tissue-preserving examination method for the neurosurgeons/neuropathologists. With the help of machine learning, a SVM classifier (Support vector machine classifier) is trained to distinguish different tissue types as quickly and easily as possible. Special emphasis is put on the analysis and differentiation of fixed tissue. Native tissue samples are used directly after removal from the surgical site and analysed using a special Raman spectroscope. A visible light image (VLI) of the sample as well as of the bevor set measuring points is always recorded, which allows a retrospective assignment of each individual spectrum to a specific measuring point. Afterwards, the tissue sample is interpreted by a neuropathologist. For fixation analyses, samples are measured once in the native state and then cryofixed by dry ice and/or preserved by a 4% formalin mixture. These samples are again analysed by a neuropathologist. For fixation, it is first noted that cryofixation with dry ice does not significantly affect the Raman spectra. From this follows the possibility of using classifiers trained on native data to analyse cryofixed tissue samples. Therefore, Raman spectroscopy could be used to explore pre-existing tumor-banks without destroying the valuable samples. Formalin fixation implicates major biochemical changes. This makes the handling of formalin-fixed samples more difficult. The classifier results could be improved by difference formation between the pure formalin spectrum and the spectrum of the formalin-fixed data. A second point of this study is based on the differentiation of dura mater and meningioma. This is first established in the differentiation of the various Raman spectra and in the clearly differentiable TSNE plots (T-distributed Stochastic Neighbor Embedding plots). After some further analyses, it can then be concluded that this discrepancy is to some extent due to the unequal collagen content as well as the varying lipid composition of these two tissue types. Last, a support vector machine classifier is trained with the available data. With these results, a virtual colouring of the sample image can be realized. Thereby, a kind of filter (heat map) is superimposed on the image, which marks meningioma-containing as well as non-meningioma-containing areas in different colours. This could allow the neurosurgeon to draw conclusions about the tissue origin with a sensitivity of 93.0% and a specificity of 89.7%. The results could be verified at a histological level. In conclusion, this new tissue-preserving and fast method is suitable for intraoperative tissue diagnostics as well as retrospective analysis of already fixed samples. Raman spectroscopy could enrich the clinical routine as a fast performable and thus simple diagnostic method. Further and in-depth studies on additional tissue entities should be performed with Raman spectroscopy to gain even more insight into its promising potential. The results of the fixation analysis, i.e., the ability to apply a classifier trained on native data to cryofixed data, opens the possibility for the exploration of tumor-banks. A large amount of data, including data on rare tumors, could be collected in a fast way, which in turn could increase the precision and accuracy of the trained classifier. In the future, a so-called omniclass classifier could be trained, a classifier that could distinguish between all possible tissue types. Further development of this method is underway, additional tumor entities are being investigated, and the goal is to integrate this method into the neurosurgeon's operating microscope. This could provide direct intraoperative feedback about the tissue that may needs to be removed.