Lokalisation von DMXL2 in der Retina

Abstract

Ribbonsynapsen sind eine spezielle Form chemischer Synapsen, die in der Retina und den cochleären sowie vestibulären Haarzellen des Ohres eine präzise und graduierte Signalübertragung ermöglichen. Die Ausstattung mit synaptischen Ribbons, an die ein schnell verfügbarer Vesikelpool gebunden ist, erlaubt eine besonders rasche, flexible Signalweiterleitung. In dieser Arbeit erfolgte die Lokalisation des Proteins DMXL2 (auch Rabconnectin3α) in der Retina. Rabconnectin3α bildet in verschiedenen chemischen Synapsen zusammen mit Rabconnectin3β den Vesikel-assoziierten Rabconnectin3-Komplex, der in die Calcium-abhängige Ausschüttung von Neurotransmittern involviert ist. In der Retina wurde dieses Protein bisher nicht erforscht. In Studien an konventionellen chemischen Synapsen des Gehirns wurde eine Bindung dieses Rabconnectin3-Komplexes an Effektoren von Rab3 nachgewiesen, dem in Ribbonsynapsen eine potenzielle Rolle bei der Bindung synaptischer Vesikel an die Ribbons zugeschrieben wird. Außerdem wurde Rabconnectin3α in Ribbonsynapsen der Haarzellen des Innenohrs mit einer Vesikel-ähnlichen Verteilung gefunden. In neuroendokrinen Zellen steuert Rabconnectin3α laut Crummy et al. (2019) zusammen mit Rabconnectin3β und CAPS1 im Komplex mit der V-ATPase den pH-Wert synaptischer Vesikel und gewährleistet damit die vollständige Befüllung synaptischer Vesikel mit Neurotransmittern. Auch in Ribbonsynapsen von Haarzellen wurde von Einhorn et al. (2012) eine Stabilisierung der V-ATPase durch DMXL2 beobachtet. Es ist wahrscheinlich, dass DMXL2 ebenso in der Retina von Bedeutung für die Signalübertragung ist, weshalb seine Anreicherung in murinem Retinagewebe in dieser Arbeit untersucht wurde. Die Lokalisation von DMXL2 erfolgte mit Hilfe von gegen dieses Protein gerichteten Antikörpern (Klon 2G2 und 12D8) in Immunfluoreszenzfärbungen von Mausretinagewebe. Es wurden sowohl Einzel- als auch Doppelimmunfluoreszenzfärbungen mit Referenzantikörpern, die bereits gut charakterisierte Proteine markierten, durchgeführt. Die Immunfluoreszenzsignale wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop und einem konfokalen Mikroskop dokumentiert. Die DMXL2-Immunsignale ließen sich in der IPL und vor allem in der OPL nachweisen und lassen in den Doppelimmunfluoreszenzaufnahmen die Annahme zu, dass DMXL2 sich in den Ribbonsynapsen der Retina präsynaptisch im Bereich der aktiven Zone befindet. Noch präzisere Aufnahmen gelangen nach der Inkubation von Retinagewebe mit dem gegen DMXL2 gerichteten Antikörperklon 2G2 auf ultrastruktureller Ebene mittels Post-embedding Immunogold-Elektronenmikroskopie. In diesen wurde die Nähe von DMXL2 zu den synaptischen Ribbons deutlich. Ein Nachweis der Spezifität dieser Antikörper für DMXL2 gelang über einen Western Blot mit einem selbst hergestellten DMXL-Fusionsprotein und einer Präabsorption des Klons 2G2 mit anschließender Nutzung in der Immunfluoreszenzfärbung. Vor dem Hintergrund, dass es sich bei DMXL2 laut bisherigen Untersuchungen an anderen chemischen Synapsen um ein Vesikel-assoziiertes Protein handelt, legt die Lokalisation der Anreicherung von DMXL2 in der Retina nahe, dass sich das Protein auf dem Ribbon-assoziierten Vesikelpool in den Photorezeptorzellsynapsen befindet. Über Interaktionen des Rabconnectin3-Komplexes mit Rab3-Effektoren könnte es somit an der Bindung von synaptischen Vesikeln an die Ribbons und damit der besonders schnellen Signalweiterleitung in Ribbonsynapsen beteiligt sein. Eine weitere mögliche Funktion von Rabconnectin3α ist die oben beschriebene, in Synapsen anderer Organe beobachtete Mitwirkung an der Steuerung der Befüllung synaptischer Vesikel mit Neurotransmittern. Dies könnte in einer Synapse, die Informationen einzelner Photonen weiterleiten kann, von großer Bedeutung sein und lässt an die Möglichkeit einer Beeinflussung der visuellen Wahrnehmung bei Fehlen des Rabconnectin3-Komplexes denken.

Ribbon synapses in the retina and in vestibular and auditory hair cells are a specialized form of chemical synapses that use graded potentials to modulate fast and thight coupled signal transmission through continuous neurotransmitter release. They are equipped with synaptic ribbons to which a rapidly available pool of synaptic vesicles is attached. In this work, the protein DMXL2 (also called Rabconnectin3α) was localized in the retina. In various chemical synapses Rabconnectin3α and Rabconnectin3β form the vesicle-associated Rabconnectin3 complex which is involved in calcium-dependent neurotransmitter release. So far there have been no studies regarding DMXL2 in the retina. Studies on conventional chemical synapses in the brain have demonstrated binding of this Rabconnectin3 complex to effectors of Rab3, which is thought to have a potential role in binding synaptic vesicles to ribbons. In addition, Rabconnectin3α was found in ribbon synapses of hair cells in the inner ear with a vesicle-like distribution. According to Crummy et al. (2019), Rabconnectin3 and CAPS1, connected to V-ATPase, regulate the pH of synaptic vesicles in neuroendocrine cells, ensuring complete filling of synaptic vesicles with neurotransmitters. Stabilization of V-ATPase by DMXL2 was also observed in ribbon synapses of hair cells by Einhorn et al. (2012). It is likely that DMXL2 is equally important for signal transduction in the retina, which is why its enrichment in murine retinal tissue was investigated in this work. Localization of DMXL2 was realised using DXML2 antibodies (clone 2G2 and 12D8) for immunofluorescence staining of mouse retinal tissue. Both single and double immunofluorescence staining were performed using reference antibodies that labeled already well-characterized proteins. Immunofluorescence signals were documented with an epifluorescence microscope and a confocal microscope. Immuno puncta could be detected in the IPL and especially strong immunostaining in the OPL, the double immunofluorescence images allow the assumption that DMXL2 is located presynaptically at the active zone of retinal ribbon synapses. Even more precise images were obtained using an electron microscope after incubation of murine retinal tissue with the DXML2 antibody clone 2G2, revealing the proximity of DMXL2 to synaptic ribbons. The specificity of 2G2 and 12D8 for DMXL2 was demonstrated by Western blotting and detecting a DMXL fusion protein and by pre-absorption of clone 2G2 followed by its use in immunofluorescence staining experiments. Given that, according to previous studies on other chemical synapses, DMXL2 is a vesicle-associated protein, the localization of DMXL2 enrichment in the retina suggests that the protein may be located on the ribbon-associated vesicle pool in photoreceptor cell synapses. Thus, via interactions of the Rabconnectin3 complex with Rab3 effectors, it could be involved in the bin-ding of synaptic vesicles to ribbons and therefore in the particularly rapid signal transduction in ribbon synapses. Another possible function of Rabconnectin3α is the involvement in controlling the filling of synaptic vesicles with neurotransmitters, which has been observed in neuroen-docrine cells and hair cells, as described above. It appears that this involvement could be of great importance in the retina, considering that retinal synapses transmit information from single photons. These findings may lead to the conclusion that the absence of the Rabconnectin3 complex would influence visual perception.