Immunhistochemische Untersuchung des Expressionsmusters einer Myosin-IX-Variante in der Retina

Abstract

Die Ribbonsynapse ist eine spezialisierte chemische Synapse, die im menschlichen Körper sowohl in der Retina, als auch der Cochlea und der Epiphyse zu finden ist. Der grundsätzliche Aufbau der Ribbonsynapse ist zwar dem der konventionellen chemischen Synapse ähnlich. Jedoch weist die Ribbonsynapse auch wichtige strukturelle und funktionelle Unterschiede auf. Das auffälligste strukturelle Unterscheidungsmerkmal der Ribbonsynapse ist der Synaptic Ribbon (dt.: synaptisches Band). Diese Struktur ermöglicht der Ribbonsynapse eine schnelle und ausdauernde (tonische) Transmitterfreisetzung. Dabei fungiert der Synaptic Ribbon, der im Elektronenmikroskop als eine elektronendichte Struktur imponiert und die mit vielen synaptischen Vesikeln assoziiert ist, als eine Art Förderband für die synaptischen Vesikel, welche den Neurotransmitter enthalten. Hauptbestandteil der Synaptic Ribbons ist das Protein RIBEYE. Immunpräzipitationen der Synaptic Ribbons mit Antikörpern gegen RIBEYE (Dembla et al., 2018) legten die Anwesenheit von Myosin-IX Varianten in retinalen Synapsen nahe. Dieser Arbeitshypothese bin ich in vorliegender Dissertationsarbeit nachgegangen. Unter Verwendung von 4 verschiedenen, unabhängigen monoklonalen Mausantikörpern gegen eine Myosin-IX Variante, die mir von der Arbeitsgruppe zur Verfügung gestellt wurden, konnte ich durch Immunfluoreszenzuntersuchungen zeigen, dass Myosin-IX tatsächlich in retinalen Synapsen, insbesondere Photorezeptorsynapsen angereichert ist. Dies habe ich durch verschiedene Doppelimmunfluoreszenzen mit den Antikörpern gegen Myosin-IX und verschiedenen Referenzantikörpern (z.B. Antikörper gegen RIBEYE, PSD95) gezeigt. Die Expression von Myosin-IX konnte auch im Western Blot verifiziert werden. Myosin-IX könnte eine Rolle für den Transport synaptischer Vesikel spielen. Dies ist besonders für die tonisch aktive Ribbonsynapse von großer Bedeutung, da in diese permanent aktive Synapse von einem effizienten, geordneten Vesikeltransport abhängig ist.

The ribbon synapse is a highly specialised chemical synapse which can be found in the cochlea, the epiphysis and retina in the human body. The molecular composition of ribbon synapses is similar to the conventional chemical synapse. But the ribbon synapse shows some important structural and functional specialization and function. The most conspicuous structural specialization that defines eponymous ribbon synapses is the synaptic ribbon. The synaptic ribbon is associated with the active zone, binds large numbers of synaptic vesicles and enables continuous and fast neurotransmitter release. The synaptic ribbon appears to work as a conveyor for synaptic vesicles and delivers them to the active zone. How the transport is accomplished is not fully understood. Motor proteins could be involved in this process. Immunoprecipitations of the synaptic ribbon with antibodies against RIBEYE (Dembla et al., 2018) suggest the existence on Myosin-IX variants in the retinal synapse. I followed this working hypothesis in this dissertation. By using 4 different, independent monoclonal mouse-antibodies, I could show through immunofluorescence that Myosin-IX indeed exists in the retinal synapses, especially in the photoreceptor synapses. I demonstrated this by using double-immunofluorescence microscopy analyses with antibodies against Myosin-IX and other antibodies for reference (for example antibodies against RIBEYE, PSD 95). The expression of Myosin-IX could also be verified by a western blot. I could show that Myosin-IX is enriched in ribbon synapses and thus could play a role in transport of synaptic vesicles. This finding is particularly important for the tonic active ribbon synapse because this permanently active synapse is dependent on an efficient and organized transport of vesicles.