Die Rolle der extrazellulären Vesikel für die Resistenzinduktion in Nierenzellkarzinomen unter Behandlung mit Pazopanib

Abstract

Die Resistenzentwicklung gegen Systemtherapien stellt ein großes therapeutisches Problem dar. Von zunehmendem Interesse ist hierbei der Einfluss der extrazellulären Vesikel bei der Resistenzübertragung. Für das Nierenzellkarzinom, das eine häufige uroonkologische Entität darstellt, wurde dies bisher nur für Sunitinib und Sorafenib untersucht. Die vorliegende Dissertation soll Einblicke in die Rolle der extrazellulären Vesikel für die Resistenzinduktion in Nierenzellkarzinomen unter der Behandlung mit Pazopanib vermitteln. In dieser Arbeit wurden Caki-2 Wildtypzellen (Caki-2 WT) und pazopanibresistente Caki-2 (Caki-2 Paz) eingesetzt, die durch die kontinuierliche Kultivierung mit 11 µM Pazopanib eine Resistenz entwickelt hatten. Zur Bestätigung der Resistenz und der Ermittlung der IC50 wurden WST-1-Viabilitätstests eingesetzt. Die Qualitätskontrolle der Exosomenisolation erfolgte mittels Western Blot und NTA-Assay. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie wurde die Exosomeninternalisierung überprüft. Bei den Experimenten zur Resistenzübertragung wurden die Caki-2 WT mit den Exosomen der resistenten Zelllinie und jenen der Wildtypzellen in verschiedenen Konzentrationen (8 und 20 µg/ml) vorbehandelt, anschließend mit 11 µM Pazopanib oder DMSO behandelt und Viabilität mittels WST-1-Test gemessen. Die IC50 der Caki-2 Paz lag bei 16,1 µM und war signifikant höher als die der Wildtypzellen mit 11,1 µM (p=0,027). Die Viabilität der Caki-2 Paz lag unter 11 µM bei 96,5% und unterschied sich signifikant von jener der Caki-2 WT mit 48,9% (p=0,0022), sodass die Resistenz der Caki-2 Paz nachgewiesen wurde. Im Western Blot konnten exosomale Marker (CD9, CD63, Alix, Syntenin) in den Exosomenisolationen nachgewiesen werden, während GM-130 als zellulärer Kontaminationsmarker nicht detektiert wurde. Die Modalwerte der Partikelgröße der Exosomen der Caki-2 WT und der Caki-2 Paz lagen in einem für Exosomen typischen Größenbereich zwischen 109,9 +/- 1,3 nm und 152,5 +/- 5,4 nm, wobei sich die Konzentrationen nicht signifikant zwischen den Zelllinien unterschieden (p=0,92). Die Aufnahme der PKH26-markierten Exosomen wurde erfolgreich fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen. In 2 von 3 Versuchen konnten die Exosomen der Caki-2 Paz die Viabilität der Caki-2 WT nicht beeinflussen und somit die Resistenz nicht übertragen. In nur einem Versuch wurde eine Viabilitätssteigerung sowohl unter DMSO (123%) als auch unter 11 µM Pazopanib (117%) bei den mit 20 µg/ml Paz-Exosomen vorbehandelten Caki-2 WT-Zellen festgestellt (normalisiert zu Caki-2 WT/Exo-WT unter DMSO). Im Rahmen dieses Versuchs fiel jedoch ein Wirkverlust von Pazopanib auf, weshalb die Zellen in diesem Versuch nur gering auf die Pazopanibbehandlung ansprachen und der Versuch mit einer anderen Charge wiederholt werden musste, wobei die Viabilitätststeigerung nicht reproduziert werden konnte. Da die Frage der exosomalen Resistenzübertragung für Pazopanib im Nierenzellkarzinom nicht abschließend geklärt werden konnte, sollten in Zukunft weitere Versuche erfolgen, wobei die Zentrifugalkraft, die Dauer der Exosomenstimulation aber auch die verwendeten Pazopanibkonzentrationen sowie die Zelllinie variiert werden könnte. Dieses Projekt verdeutlicht, wie störungsanfällig solche funktionellen Untersuchungen sind und wie wichtig ein einheitliches methodisches Vorgehen bei Studien zu extrazellulären Vesikeln und der Übertragung von Medikamentenresistenzen ist, um eine gute Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit zu erreichen.

The development of resistance to systemic therapies is a major therapeutic issue. In this context, the influence of extracellular vesicles in the transmission of resistance is of increasing interest. In renal cell carcinoma, which is a common uro-oncologic entity, this has only been studied for sunitinib and sorafenib. This doctoral thesis aims to provide insights into the role of extracellular vesicles in the induction of resistance against pazopanib in renal cell carcinomas. The wild-type Caki-2 (Caki-2 WT) and the pazopanib-resistant Caki-2 (Caki-2 Paz) cells that had developed resistance by continuous culture with 11 µM pazopanib were used. In order to confirm the resistance and to determine the IC50 the WST-1 viability assay was used. The quality control of the exosome isolation was performed by Western blot and NTA assay. As a control of the exosome internalization fluorescence microscopy was used. In the drug resistance transfer experiments, Caki-2 WT were pretreated with the exosomes of the resistant cell line and those of the wild-type cells at different concentrations (8 and 20 µg/ml), then treated with 11 µM pazopanib or DMSO, and the viability was measured by WST-1 assay. The IC50 of Caki-2 Paz (16.1 µM) was significantly higher than that of the wild-type cells (11.1 µM, p=0.027). The viability of Caki-2 Paz under 11 µM was 96.5% and significantly different from that of Caki-2 WT (48.9%, p=0.0022), demonstrating the resistance of Caki-2 Paz. Western blot detected exosomal markers (CD9, CD63, Alix, Syntenin) in the exosome isolations, while GM-130 as a marker of cellular contamination could not be detected. The modal values of the particle size of the exosomes of Caki-2 WT and Caki-2 Paz were typical for exosomes ranging from 109.9 +/- 1.3 nm to 152.5 +/- 5.4 nm, and concentrations were not significantly different between the cell lines (p=0.92). The uptake of PKH26-labeled exosomes was successfully confirmed by fluorescence microscopy. In 2 of 3 experiments, Caki-2 Paz exosomes failed to affect the viability of the Caki-2 WT cells and thus failed to confer resistance. In only one experiment, an increased viability was observed under both DMSO (123%) and 11 µM pazopanib (117%) in Caki-2 WT cells pretreated with 20 µg/ml Paz exosomes (normalized to Caki-2 WT/Exo-WT under DMSO). However, a loss of the effect of pazopanib was noticed in this experiment, and therefore the cells in this experiment showed only a low response to the pazopanib treatment and the experiment had to be repeated with a different batch. Unfortunately, the increase of viability could not be reproduced. Since the issue of exosomal transfer of resistance to pazopanib in renal cell carcinoma could not be conclusively addressed, further experiments should be performed in the future, where the centrifugal force, the duration of exosome stimulation but also the pazopanib concentrations used as well as the cell line could be varied. This project illustrates the susceptibility for interferences of such functional studies and the importance of a uniform methodological approach to extracellular vesicle and drug resistance transfer studies, to achieve good comparability and reproducibility.