HPV8 E6-vermittelte Monozyten-Migration und Induktion des CCL2 Chemokins über den C/EBPα-p63-Signalweg in humanen Keratinozyten

Abstract

Humane Papillomviren sind mit der Entstehung verschiedener Krebsformen assoziiert. Die beiden β-HPV Typen HPV5 und HPV8 infizieren die Haut und es mehren sich Hinweise für eine bedeutende Co-Faktorrolle in der UV-induzierten kutanen Karzinogenese. Insbesondere Patienten, die an der seltenen Genodermatose Epidermodysplasia verruciformis (EV) leiden, weisen eine hohe Suszeptibilität für eine persistente Infektion mit kutanen β-HPV auf. Dies führt in 30-60 % der Fälle zur Entwicklung kutaner Plattenepithelkarzinome, vornehmlich an sonnenexponierten Körperstellen. Kürzlich wurde von unserer Arbeitsgruppe der Transkriptionsfaktor C/EBPα als neues Target des HPV8 E6 Proteins identifiziert, dessen Repression zur erhöhten Expression des Stammzellfaktors ΔNp63α führt und dadurch suprabasale Keratinozyten in einem proliferativen Zustand hält. Des Weiteren wurde in vorangegangenen Experimenten gezeigt, dass HPV8-positive EV-Läsionen zwar weniger Langerhanszellen im Epithel aufweisen, im Stroma jedoch von einem deutlichen inflammatorischen Immunzellinfiltrat begleitet werden. In diesem Infiltrat konnten u.a. Makrophagen nachgewiesen werden. Es war bisher jedoch unklar, auf welchem Mechanismus die Rekrutierung von Monozyten bzw. Makrophagen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass das HPV8 E6 Protein, aber nicht E7, die Expression des CCL2 Chemokins in humanen Keratinozyten induziert und dadurch die CCL2/CCR2-abhängige in vitro Migration von Monozyten stimuliert. Mittels Knockdown- und Reportergenversuchen in der HaCaT Zelllinie und in primären Vorhautkeratinozyten konnte der C/EBPα-p63-Signalweg als Regulator der HPV8 E6-abhängigen CCL2 Induktion identifiziert werden. Außerdem erwies sich in Überexpressionsanalysen die ΔNp63α Isoform, die vorherrschende Isoform in Keratinozyten, als positiver Regulator der CCL2 Expression. In einem Screening zur Aktivitätsbestimmung von Kinasen konnte des Weiteren gezeigt werden, dass HPV8 E6 zu einer Induktion von Proteinkinase A-Cα in ihrer aktiven Form führt, die unabhängig von dem C/EBPα-p63-Signalweg an der 8E6-abhängigen CCL2 Induktion beteiligt sein könnte. Durch Genexpressionsanalysen wurden weitere Gene identifiziert, die potenziell von HPV8 E6 über den C/EBPα-p63-Signalweg reguliert werden. Hierbei zeigte sich der C/EBPα-p63-Signalweg als bedeutender Aktivator eines proliferativen und inflammatorischen Genprogramms. Für den HPV8-Lebenszyklus könnte ein solches inflammatorisches Programm von Vorteil sein, da bekannt ist, dass inflammatorische Faktoren den HPV8 Promotor aktivieren und somit die virale Replikation verstärken könnten. Als Nebeneffekt könnte die chronische Inflammation über sekundäre Mechanismen eine maligne Progression von benignen Läsionen bei EV-Patienten begünstigen. Demnach stellt die 8E6-induzierte CCL2 Expression und insbesondere der C/EBPα-p63-Signalweg einen potenziellen Ansatzpunkt zur Therapie HPV8-induzierter Erkrankungen dar.

Human Papillomaviruses are associated with the development of various forms of cancer. The two β-HPV types HPV5 and HPV8 infect the skin and there is increasing evidence for a significant co-factor role in UV-induced cutaneous carcinogenesis. In particular, patients suffering from the rare genodermatosis Epidermodysplasia verruciformis (EV) have a high susceptibility to persistent infection with cutaneous β-HPV. This leads to the development of cutaneous squamous cell carcinoma in 30-60% of cases, primarily on sun-exposed body sites. Recently, our group identified the transcription factor C/EBPα as a novel target of the HPV8 E6 protein, whose repression leads to increased expression of the stem cell factor ΔNp63α, thereby maintaining suprabasal keratinocytes in a proliferative state. Furthermore, previous experiments have shown that HPV8-positive EV lesions have fewer Langerhans cells in the epithelium but are accompanied by a distinct inflammatory immune cell infiltrate in the stroma. Macrophages, among others, could be detected in this infiltrate. However, it was previously unclear on which mechanism the recruitment of monocytes or macrophages is based. In the present work, HPV8 E6 protein, but not E7, was shown to induce CCL2 chemokine expression in human keratinocytes, thereby stimulating CCL2/CCR2-dependent in vitro migration of monocytes. Using knockdown and reporter gene experiments in the HaCaT cell line and in primary foreskin keratinocytes, the C/EBPα-p63 pathway was identified as a regulator of HPV8 E6-dependent CCL2 induction. In addition, overexpression analyses revealed the ΔNp63α isoform, the predominant isoform in keratinocytes, as a positive regulator of CCL2 expression. A kinase activity assay screen further demonstrated that HPV8 E6 leads to induction of protein kinase A-Cα in its active form, which may be involved in 8E6-dependent CCL2 induction independently of C/EBPα-p63 signaling. Gene expression analyses identified additional genes potentially regulated by HPV8 E6 through the C/EBPα-p63 pathway. Here, the C/EBPα-p63 pathway was shown to be a significant activator of a proliferative and inflammatory gene program. For the HPV8 life cycle, such an inflammatory program could be beneficial, as it is known that inflammatory factors could activate the HPV8 promoter and thus enhance viral replication. As a side effect, chronic inflammation could promote malignant progression of benign lesions in EV patients via secondary mechanisms. Accordingly, 8E6-induced CCL2 expression and, in particular, the C/EBPα-p63 pathway represent a potential target for therapy of HPV8-induced diseases.