Immunhistochemische Charakterisierung epithelialer Zelltypen der Zervix uteri

Abstract

Hintergrund: Das Zervixkarzinom steht mit jährlich einer halben Million Neuerkrankungen aktuell an vierter Stelle der häufigsten Krebserkrankungen der Frau weltweit. Die zentrale ätiologische Ursache dieser malignen Erkrankung ist eine Infektion mit humanen Papillomviren (1–3). Durch ein genaueres Verständnis der bei der zervikalen HPV-getriebenen Karzinogenese ablaufenden Prozesse sowie der daran beteiligten zellulären Faktoren, können wichtige Ansätze zur präziseren Diagnostik und Therapie geschaffen werden. Die Proteine Lgr4, Lgr5 und Lgr6 wurden in der Literatur bereits in mehreren Organen als Marker für Stammzellen beschrieben. Als Bestandteil des Wnt-Signalwegs, welcher, bei Aktivierung in Tumorzellen, mit der Karzinomentstehung assoziiert wird, verstärken sie dessen Signaltransduktion. Vorausgegangene Daten zeigen eine Expression in gesundem zervikalem Gewebe von Reservezellen und frühen Progenitoren im unreifen Plattenepithel (4–9). Zudem konnte bereits gesehen werden, dass die Lgr5-Expression von frühen Vorstufen (CIN I) bis zum Zervixkarzinom ansteigt und somit bei der zervikalen Karzinogenese eine Rolle spielen könnte (10). Bezüglich Lgr4 und Lgr6 sind bisher kaum Untersuchungen vorhanden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Expressionsmuster von Lgr4, Lgr5 und Lgr6 in zervikalen intraepithelialen Neoplasien und Zervixkarzinomen untersucht werden. Die häufigste Ursache einer malignen Transformation ist eine Infektion mit Hochrisiko-HPV-Typen. p16INK4a gilt in der Literatur als Surrogatmarker für Zellen, die durch eine HPV-getriebene Transformation gekennzeichnet sind (11,12). Durch den Vergleich der Lgr- und p16INK4a-Färbung sollte erarbeitet werden, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression von p16INK4a und Lgr4, Lgr5 und Lgr6 während der zervikalen Karzinogenese besteht. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob die Lgr-positiven Zellen durch Zellproliferation und verstärkte Proteinbiosynthese gekennzeichnet sind, um die während der zervikalen Karzinogenese ablaufenden Mechanismen besser zu verstehen. Das Ki67-Protein wurde als Zellproliferationsmarker verwendet. Die Zellen mit einer verstärkten Proteinbiosynthese wurden mittels p70S6K, einem Marker für einen aktiven mTOR-Signalweg, identifiziert. Des Weiteren galt es die Hypothese von Herfs et al. zu überprüfen laut der ca. 40 CD63-positive, für den Bereich der squamocolumnar junction (SCJ) spezifische Zellen, eine Rolle bei der Karzinomentstehung spielen könnten. Laut Herfs et al. seinen alle Neoplasien innerhalb der SCJ CD63 positiv und alle außerhalb entstandenen CD63 negativ (13). Methoden: Es wurden Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebeschnitte untersucht. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden die Expressionsmuster von Lgr4, Lgr5, Lgr6, p16INK4a, CD63, p70S6K und Ki67 in zervikalen intraepithelialen Neoplasien und Zervixkarzinomen analysiert und Gemeinsamkeiten bezüglich deren Ausbreitung innerhalb der Epithelschichten, im subepithelialen Stroma und an Drüsen dargestellt. Die Auswertung erfolgte an einem Mikroskop in unterschiedlichen Vergrößerungen. Ergebnisse: Die Lgr-Färbung nimmt mit dem Grad der Dysplasie zu. Sie konzentriert sich in den unterschiedlichen Läsionen auf Bereiche, die durch Transformation gekennzeichnet sind. Diese Bereiche nehmen von CIN I bis zum Zervixkarzinom zu. Die p16INK4a-positiven Gewebeabschnitte lagen in den Lgr-positiven Geweben. Diese überlappenden Muster zeigten sich am deutlichsten in der Lgr6-Färbung. Eine durchgehende Positivität von p16INK4a und Lgr konnte ab CIN III gefunden werden. In den Karzinomnestern war in beiden Färbungen eine durchgehende Positivität zu verzeichnen. Die CD63-Färbung verhielt sich in den untersuchten Epithelien gegensätzlich zur Lgr- und p16INK4a-Färbung. In der p70S6K-Färbung expandierten die positiven Zellen mit dem Grad der Malignität einer Läsion zur Superfizialzellschicht hin. Schlussfolgerungen: Die Lgr-Proteine können im Zusammenhang mit der Krebsentstehung stehen, da sie Zellen färben, die p16INK4a-positiv und die somit durch eine HPV-getriebene Transformation gekennzeichnet sind. Insbesondere die Kombination aus p16INK4a und Lgr6 könnte als Marker für progrediente CINs etabliert werden. Des Weiteren ist denkbar, dass die Zielzellen der HPV im Bereich der Basalzellschicht Stammzellen sind, denn sie werden durch Stammzellmarker gefärbt. CD63 scheint keine Rolle in der zervikalen Karzinogenese zu spielen, da mit dem Anstieg des Dysplasiegrades eine Abnahme der CD63-Positivität gesehen werden kann.

Background: With half a million new cases every year, cervical carcinoma is currently the fourth most common form of cancer in women worldwide. The central etiological cause of this disease is infection with human papillomaviruses. A more detailed understanding of the processes involved in cervical hpv-driven carcinogenesis and the cellular factors involved will provide important approaches for more precise diagnosis and therapy. The proteins Lgr4, Lgr5 and Lgr6 have been described in the literature as markers for stem cells in several organs. As a component of the wnt-signaling pathway, which when activated in tumor cells is associated with carcinogenesis, they enhance its signal transduction. Previous data show expression in healthy cervical tissue of reserve cells and early progenitors in immature squamous epithelium. In addition, Lgr5 expression has already been seen to increase from early precursors (CIN I) to cervical carcinoma and thus may play a role in cervical carcinogenesis. Regarding Lgr4 and Lgr6, there are hardly any studies available so far. In this work, the expression pattern of Lgr4, Lgr5 and Lgr6 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma should be investigated. The most common cause of malignant transformation is infection with high-risk HPV types. p16INK4a is considered in the literature as a surrogate marker for cells characterized by HPV-driven transformation. By comparing Lgr and p16INK4a staining, we aimed to work out whether there is a relationship between the expression of p16INK4a and Lgr4, Lgr5, and Lgr6 during cervical carcinogenesis. In addition, to investigate whether the Lgr-positive cells are characterized by cell proliferation and enhanced protein biosynthesis to better understand the mechanisms occurring during cervical carcinogenesis. Ki67 protein was used as a cell proliferation marker. The cells with enhanced protein biosynthesis were identified using p70S6K, a marker for an active mTOR signaling pathway. Furthermore, the hypothesis of Herfs et al. that approximately 40 CD63-positive cells specific for the squamocolumnar junction (SCJ) area may play a role in carcinogenesis was tested. According to Herfs et al. all neoplasms within the SCJ are CD63 positive and all neoplasms arising outside the SCJ are CD63 negative. Methods: Formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue sections were examined. Immunohistochemical staining was used to analyze the expression patterns of Lgr4, Lgr5, Lgr6, p16INK4a, CD63, p70S6K, and Ki67 in cervical intraepithelial neoplasms and cervical carcinomas, and to show commonalities regarding their spread within epithelial layers, in the subepithelial stroma, and on glands. The evaluation was performed on a microscope at different magnifications. Results: Lgr staining increases with the degree of dysplasia. It is concentrated in the different lesions in areas characterized by transformation. These areas increase from CIN I to cervical carcinoma. The p16INK4a-positive tissue sections were located in the Lgr-positive tissues. These overlapping patterns were most evident in Lgr6 staining. Continuous positivity of p16INK4a and Lgr was found from CIN III onward. In carcinoma nests, there was consistent positivity in both stains. CD63 staining behaved opposite to Lgr and p16INK4a staining in the epithelia examined. In p70S6K staining, positive cells expanded toward the superficial cell layer with the degree of malignancy of a lesion. Conclusions: The Lgr proteins may be related to carcinogenesis as they stain cells that are p16INK4a-positive and thus characterized by HPV-driven transformation. In particular, the combination of p16INK4a and Lgr6 could be established as a marker for progressive CINs. Furthermore, it is conceivable that the target cells of HPV in the basal cell layer are stem cells, as they are stained by stem cell markers. CD63 does not appear to play a role in cervical carcinogenesis, as a decrease in CD63 positivity can be seen with an increase in the degree of dysplasia.