Die Konzentration von Bisphenol A (BPA), Malondialdehyd (MDA) und reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Serum & Follikelflüssigkeit sowie deren Einfluss auf ICSI Ergebnisse.

Abstract

Der Weichmacher „Bisphenol A“ (BPA) ist aus der industriellen Kunststoffherstellung nicht mehr wegzudenken. Bisphenol A kommt in zahlreichen Materialien mit Lebensmitteln in Kontakt, da es unter anderem bei der Herstellung von Polycarbonat und Epoxidphenolharzen verwendet wird. Polycarbonat ist ein weit verbreiteter und einfach zu verarbeitender Kunststoff, der beispielsweise in Babyflaschen, Geschirr, Vorratsbehältern, Lebensmittelverpackungen oder nachfüllbaren Wasserbehältern zu finden ist. Epoxid-Phenolharze werden unter anderem als Innenbeschichtung für Konserven- und Getränkedosen sowie als Beschichtung für Metalldeckel von Tiegeln und Flaschen verwendet. Sie werden auch als Oberflächenbeschichtung für Trinkwasserspeicher verwendet (Saiyood et al., 2010; Tsai et al., 2009). Bisphenol A hat sowohl in vitro als auch in vivo eine nachgewiesene östrogenähnliche Wirkung und zählt zu den sogenannten „endokrinen Disruptoren“. Es steht im Verdacht, gesundheits- und erbgutschädigend zu sein (Vandenberg et al., 2007; Flint et al., 2012). Bereits 2006 schätzten Experten den jährlichen Verbrauch von Bisphenol A in der Europäischen Union auf über 640.000 Tonnen. Bis 2006 galt für die maximale Aufnahme pro Tag ein Grenzwert von 10 µg pro kg Körpergewicht. Aufgrund teilweise noch unveröffentlichter Studien, wonach auch höhere Dosen unbedenklich sein sollen, hat die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit den Grenzwert auf 50 µg/kg pro Tag angehoben. Auch der Migrationswert wurde erhöht (er bestimmt, wie viel Bisphenol A ein Lebensmittel durch den Kontakt mit der Verpackung aufnehmen kann). Bisphenol (BPA), reaktive Oxygen Spieles (ROS) und Malondialdehyd (MDA) wurden im Serum und in der Follikelflüssigkeit gemessen. Diese Ergebnisse wurden auf einen Zusammenhang mit dem Alter der Patientinnen, dem Body-Mass-Index, dem Stimulationsprotokoll und dem Ergebnis während und nach ICSI Behandlung (Fertilisationsrate, Teilungsrate der Embryonen und Entstehen einer Schwangerschaft) untersucht. Ziel dieser Studie war es, einen Zusammenhang zwischen den Konzentrationen von BPA, MDA- und ROS- sowohl in der Follikelflüssigkeit als auch im Serum mit dem Outcome der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI – Therapie) zu bestimmen. Darüber hinaus sollte die Beziehung zwischen den BPA-, MDA- und ROS-Spiegeln im Serum und in der Follikelflüssigkeit bezüglich der Ätiologie der Unfruchtbarkeit, dem Alter der Patienten und dem Body-Mass-Index der Schwangeren untersucht werden. In dieser Studie wurden 86 Paare eingeschlossen, die sich im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung einer Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) an der Frauenklinik der Universität Sohag in Ägypten unterzogen. Die Frauen wurden nach Alter in drei Gruppen eingeteilt, wobei die erste Altersgruppe 18–30 Jahre alt war (n = 21), die zweite Altersgruppe 30–35 Jahre alt war (n = 36 Patientinnen) und der dritten Altersgruppe >35 (n=29) Patienten zugeordnet werden konnten. Bezüglich der Sterilitätsursache wurden die Patientinnen in 4 Gruppen eingeteilt: in die erste Gruppe (G.1; n = 10) Patientinnen mit bekannter Endometriose, in die zweite Gruppe Patientinnen mit bekannter andrologischer Ursache (G.2; n = 17) und in eine dritte Gruppe (G.3; n = 25) die Patientinnen mit pathologischem Menstruationszyklus. Die vierte Gruppe bilden die Patientinnen mit ungeklärter Ursache (idiopathisch) (n = 21). Darüber hinaus wurden die Patienten basierend auf dem Body-Mass-Index (BMI) in 4 Gruppen eingeteilt: Untergewicht (n=4), Normalgewicht (50), Übergewicht (n=19) und Fettleibigkeit (n=4). Des Weiteren wurden die Patientinnen gemäß dem Protokoll zur kontrollierten ovariellen Hyperstimulation (COH) in drei Gruppen eingeteilt. Menschliches menopausales Gonadotropin (HMG, Gruppe 1) wurde nur bei 3 Patientinnen verwendet. Rekombinantes FSH wurde bei 34 Patienten verwendet und ein gemischtes Stimulationsprotokoll (n = 47) wurde bei 47 Patientinnen durchgeführt. Nach der Behandlung wurden die Patientinnen in zwei Gruppen schwanger (n=35) und nicht schwanger (n=51) aufgeteilt. Die Kontrolle der ovariellen Hyperstimulation (COH), Patientennachsorge und Probenentnahme erfolgte folgendermaßen: Zur Stimulation der Eierstöcke wurde ein langes GnRH-Agonisten-Protokoll verwendet. Die Gabe des GnRH - Agonist (Leuprorelin; TAP Pharmaceuticals) erfolgte am 21. Zyklustag des vorherigen Zyklus (21.Tag nach Einsetzen der Menstruation). Die Stimulation mit Gonadotropin wurde mit Gonal-F (Gonal-F, Merck-Serono, Deutschland) ab dem 2. Tag des Menstruationszyklus begonnen. Darauf erhielten die Patientinnen 10.000 IE HCG Humanes Choriongonadotropin (hCG, Pregnel) und 36 Stunden nach Verabreichung von HCG eine transvaginale, ultraschallgesteuerte Follikelpunktion sowie eine Blutentnahme. Das Blut wurde während der Eizellentnahme abgenommen, zentrifugiert und das Serum aus diesem Blut wurde bei -80° C aufbewahrt. Nach der Entnahme der Oozyten aus der Follikelflüssigkeit wurden etwa 3,0 – 8,0 ml Follikelflüssigkeit in sterile konische Röhrchen (BD Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) überführt und bei 250 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Dann wurde der blutfreie Überstand aliquotiert und bis zur weiteren Auswertung bei –80°C gelagert. Das intrazytoplasmatische Spermieninjektionsverfahren (ICSI) wurde am selben Tag durchgeführt. Serum- und Follikelflüssigkeitsproben wurden aufgetaut und sofort zur Bestimmung der Lipidperoxidation (LPO) unter Verwendung einer modifizierten Thiobarbitursäure (TBA) gemäß dem Verfahren von Hammadeh et al. (2010) verwendet und die Ergebnisse werden als Malondialdehyd, MDA in nmol pro Liter angegeben. Die Bisphenol A -Konzentration im Serum und in der Follikelflüssigkeit wird mit einem hochempfindlichen Analyseverfahren bestimmt. Das Ecologiena® Supersensitive BPA ELISA KIT wurde für die Messung der Bisphenol A Spiegel verwendet. Die Konzentration von ROS wurde durch einen kolorimetrischen Assay zur quantitativen Bestimmung von Peroxiden in EDTA-Plasma, Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung des ELISA-Kits (Oxy Stat; Kat.-Nr. BI-5007 Biomedical Medicine product GmbH & Co KG, Wien, Österreich). Die mittlere Serum- Bisphenol A -Konzentration betrug 12,9 ± 2,9 µg/ml. Bei den Patientinnen, bei denen keine Schwangerschaft herbeigeführt werden konnte (Gravida-negativ), fand sich ein etwas höherer Wert als bei den Patientinnen, die schwanger wurden, jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen (13,4±3,0 vs. 12, 2± 2,9 µg/ml; p=0,062). In der Follikelflüssigkeit (FF) waren die durchschnittlichen Bisphenol A -Konzentrationen nur etwa halb so hoch wie im Serum (5,7 ± 0,1 µg/ml). Zwischen BPA (Bisphenol A) und der Ursache der Unfruchtbarkeit konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang nachgewiesen werden. Die mittleren Serum- Bisphenol A -Konzentrationen waren bei allen untersuchten Ursachen der Unfruchtbarkeit auf dem gleichen Niveau; die Werte lagen in einem Bereich von 12,0 bis 13,8 µg/ml (Mittelwerte) bzw. 11,4 und 14,1 µg/ml (Median). Bei den Malondialdehyd -Konzentrationen waren die Befunde qualitativ ähnlich wie bei den Bisphenol A Konzentrationen. Die mittleren Konzentrationen von Malondialdehyd im Serum waren mehr als doppelt so hoch wie in der Follikelflüssigkeit; bei nicht schwangeren Frauen wurden etwas höhere Werte gefunden als bei Patientinnen, die schwanger wurden. Die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Für Malondialdehyd in der Follikelflüssigkeit ergab sich ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Unfruchtbarkeitsursache mit dem höchsten und niedrigsten Malondialdehyd -Mittelwert (pathologischer Zyklus vs. andrologische Ursache: 2,7±1,6 vs. 1,9±0,7 µg/ml; p=0,036). Bei den Untersuchungen zu Reactive Oxygen Species (ROS) zeigte sich, dass die Werte im Serum mehr als doppelt so hoch waren wie in der Follikelflüssigkeit (596,2 ± 161,1 µM/l im Serum; 232,1 ± 162,3 µM/l im FF). Allerdings war die Konzentration bei Patientinnen, die schwanger wurden und denen, die nicht schwanger wurden, auf dem gleichen Niveau. Außerdem wurden bei den Patientinnen, die schwanger wurden, leicht höhere Reactive Oxygen Species Werte im Serum und in der Follikelflüssigkeit gefunden. Die Unterschiede erreichen jedoch keine statistische Signifikanz. Das Durchschnittsalter der Patientinnen, die nicht schwanger wurden, war etwas höher als das der Patientinnen, die schwanger wurden (33,6 ± 5,0 vs. 32,8 ± 3,9; p = 0,447 (t-Test). Außerdem gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem Alter und der Befruchtungsrate (r=0,138; p=0,206; Pearson-Test). Auch der Body – Mass - Index hatte in dieser Studiengruppe keinen erkennbaren Einfluss auf die Schwangerschaft, der durchschnittliche Body – Mass - Index der Gravida-positiven und Gravida-negativen Frauen war ungefähr gleich (23,1±3,5 vs. 23,8±4,3; p=0,646 Mann-Whitney-Test), allerdings zeigte sich eine tendenziell schwach negative Korrelation zwischen dem Body – Mass - Index und Befruchtungsrate (p=0,071). Schlussfolgerung: Es konnte keine signifikante Korrelation zwischen der Bisphenol A Konzentration im Serum oder in der Follikelflüssigkeit und den anderen untersuchten Parametern gefunden werden. Außerdem gibt es in dieser Untersuchung keine Korrelationen zwischen dem Bisphenol A Spiegel und dem Alter, dem Body-Mass-Index, der Befruchtungsrate, der Embryonalentwicklung, der Implantation und den klinischen Ergebnissen der Kinderwunschbehandlung. Malondialdehyd zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Ätiologie der Unfruchtbarkeit. Die Ergebnisse dieser Studie sollen Ärztinnen und Ärzten auf dem Gebiet der assistierten Reproduktion weitere Informationen im Zusammenhang mit den Risiken täglicher Exposition gegenüber den endokrin wirksamen Substanzen (EDC) und deren Auswirkungen auf die assistierte Reproduktion liefern. Es besteht jedoch weiterhin ein großer Bedarf an epidemiologischen Studien, um die Auswirkungen von Bisphenol A mit klinisch relevanten Ergebnissen aufzuklären.

The plasticizer " Bisphenol A" (BPA) has become an indispensable part of industrial plastic production. Bisphenol A comes into contact with food in numerous materials, as it is used in the production of polycarbonate and epoxy phenolic resins, among others. Polycarbonate is a widely used and easy-to-process plastic found, for example, in baby bottles, tableware, storage containers, food packaging and refillable water containers. Epoxy phenolic resins are used, among other things, as internal coatings for food and beverage cans and as coatings for metal lids of jars and bottles. They are also used as surface coatings for drinking water storage tanks (Saiyood et al., 2010; Tsai et al., 2009). Bisphenol A has been shown to have estrogen-like effects both in vitro and in vivo and is one of the so-called "endocrine disruptors." It is suspected of being harmful to health and genetic material (Vandenberg et al., 2007; Flint et al., 2012). As early as 2006, experts estimated the annual consumption of bisphenol A in the European Union at over 640,000 metric tons. Until 2006, the maximum daily intake was limited to 10 μg per kg body weight. Due to studies, some of which have not yet been published, according to which even higher doses are supposed to be harmless, the European Food Safety Authority raised the limit to 50 μg/kg per day. The migration value was also increased (it determines how much bisphenol A a food can absorb through contact with the packaging). Bisphenol (BPA), reactive oxygen plays (ROS) and malondialdehyde (MDA) were measured in serum and follicular fluid. These results were examined for association with patient age, body mass index, stimulation protocol, and outcome during and after ICSI treatment (fertilization rate, embryo division rate, and pregnancy emergence). The aim of this study was to determine a relationship between the concentrations of BPA, MDA- and ROS- in both follicular fluid and serum with the outcome of intracytoplasmic sperm injection (ICSI - therapy). In addition, to investigate the relationship between serum and follicular fluid BPA, MDA, and ROS levels in relation to the etiology of infertility, the age of the patients, and the body mass index of the pregnant women. This study included 86 couples who underwent intracytoplasmic sperm injection (ICSI) as part of fertility treatment at Sohag University Women's Hospital in Egypt. Women were divided into three groups according to age, the first age group being 18-30 years old (n = 21), the second age group being 30-35 years old (n = 36 patients), and the third age group being >35 (n=29) patients. Regarding the cause of infertility, patients were divided into 4 groups: in the first group (G.1; n = 10) patients with known endometriosis, in the second group patients with known andrological cause (G.2; n = 17) and in a third group (G.3; n = 25) the patients with pathological menstrual cycle. The fourth group was the patients with unexplained cause (idiopathic) (n = 21). In addition, patients were divided into 4 groups based on body mass index (BMI): Underweight (n = 4), Normal weight (50), Overweight (n = 19), and Obese (n = 4). Furthermore, patients were divided into 3 groups according to the controlled ovarian hyperstimulation (COH) protocol. Human menopausal gonadotropin (HMG, group 1) was used only in 3 patients. Recombinant FSH was used in 34 patients, and a mixed stimulation protocol (n = 47) was performed in 47 patients. After treatment, patients were divided into two groups pregnant (n=35) and not pregnant (n=51). Ovarian hyperstimulation (COH) control, patient follow-up, and sample collection were performed as follows: A long GnRH agonist protocol was used for ovarian stimulation. The GnRH - agonist (leuprorelin; TAP Pharmaceuticals) was administered on the 21st cycle day of the previous cycle (21st day after the onset of menstruation). Gonadotropin stimulation was started with Gonal-F (Gonal-F, Merck-Serono, Germany) from the 2nd day of the menstrual cycle. Following this, patients received 10,000 IU HCG human chorionic gonadotropin (hCG, Pregnel) and 36 hours after HCG administration, transvaginal ultrasound-guided follicular puncture and blood sampling were performed. Blood was drawn during oocyte collection, centrifuged, and serum from this blood was stored at -80°C. After oocytes were collected from the follicular fluid, approximately 3.0 - 8.0 ml of follicular fluid was transferred to sterile conical tubes (BD Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) and centrifuged at 250 x g for 10 minutes at room temperature. Then, the blood-free supernatant was aliquoted and stored at -80°C until further analysis. The intracytoplasmic sperm injection (ICSI) procedure was performed on the same day. Serum and follicular fluid samples were thawed and immediately used for lipid peroxidation (LPO) determination using a modified thiobarbituric acid (TBA) according to the procedure of Hammadeh et al. (2010), and results are reported as malondialdehyde, MDA in nmol per liter. Bisphenol A concentration in serum and follicular fluid is determined using a highly sensitive analytical method. The Ecologiena® Supersensitive BPA ELISA KIT was used to measure bisphenol A levels. The concentration of ROS was determined by a colorimetric assay for the quantitative determination of peroxides in EDTA plasma, serum and other biological fluids using the ELISA kit (Oxy Stat; Cat. No. BI-5007 Biomedical Medicine product GmbH & Co KG, Vienna, Austria). The mean serum bisphenol A concentration was 12.9 ± 2.9 μg/ml. In the patients in whom pregnancy could not be induced (gravida-negative), a slightly higher value was found than in the patients who became pregnant, but no significant difference between the two groups (13.4±3.0 vs. 12, 2± 2.9 μg/ml; p=0.062). In follicular fluid (FF), mean bisphenol A concentrations were only about half those in serum (5.7±0.1 μg/ml). No statistically significant relationship was demonstrated between BPA (bisphenol A) and the cause of infertility. Mean serum bisphenol A concentrations were at the same level for all causes of infertility studied; values ranged from 12.0 to 13.8 μg/ml (mean) and 11.4 and 14.1 μg/ml (median), respectively. For malondialdehyde concentrations, the findings were qualitatively similar to those for bisphenol A concentrations. Median concentrations of malondialdehyde in serum were more than twice those in follicular fluid; slightly higher levels were found in nonpregnant women than in patients who became pregnant. However, the differences were not significant. For malondialdehyde in follicular fluid, there was a statistically significant difference between the infertility cause with the highest and lowest malondialdehyde mean (pathological cycle vs. andrological cause: 2.7±1.6 vs. 1.9±0.7 μg/ml; p=0.036). Reactive Oxygen Species (ROS) assays showed that levels in serum were more than twice those in follicular fluid (596.2 ± 161.1 μM/l in serum; 232.1 ± 162.3 μM/l in FF). However, the concentration was at the same level in patients who became pregnant and those who did not. In addition, slightly higher Reactive Oxygen Species levels were found in serum and follicular fluid in the patients who became pregnant. However, the differences did not reach statistical significance. The mean age of the patients who did not become pregnant was slightly higher than that of the patients who did (33.6 ± 5.0 vs. 32.8 ± 3.9; p = 0.447 (t-test). Moreover, there was no significant correlation between age and fertilization rate (r=0.138; p=0.206; Pearson test). Body - mass - index also had no discernible influence on pregnancy in this study group, the average body - mass - index of gravida-positive and gravida-negative women was approximately equal (23.1±3.5 vs. 23.8±4.3; p=0.646 Mann-Whitney test), however, there was a tendency of weak negative correlation between body - mass - index and fertilization rate (p=0.071). Conclusion: no significant correlation was found between bisphenol A concentration in serum or follicular fluid and the other parameters studied. Moreover, there are no correlations between bisphenol A level and age, body mass index, fertilization rate, embryonic development, implantation, and clinical outcomes of infertility treatment in this study. Malondialdehyde showed a statistically significant difference between the etiology of infertility. The results of this study provides physicians in the field of assisted reproduction with further information related to the risks assonbciated with daily exposure to this endocrine disrupting chemical (EDC) and outcomes in assisted reproduction. However, there is still a great need for epidemiological studies to elucidate the effects of bisphenol A with clinically relevant results.