Etablierung eines personalisierten präklinischen in-vivo Modells des Nierenzellkarzinoms

Abstract

Ein großer Teil der Erkenntnisse aus der experimentellen Forschung zum Nierenzellkar-zinom kann durch den Mangel an stabilen, repräsentativen in-vivo Modellen nicht auf den klinischen Alltag und die Patientenversorgung übertragen werden. Zeit- und kosten-aufwändige Tumorgrafts stellen zwar realitätsnahe Mausmodelle dar, jedoch ist ein An-wachsen der Tumore nur selten erfolgreich und die Untersuchungsmöglichkeiten bezüg-lich Standardisierung und parallelen in-vitro Versuchen sind sehr eingeschränkt. Etablier-te aus aggressiven Tumoren generierte Zelllinien, wie die hier verwendete Nierenzellkar-zinomzelllinie CAKI-2, befinden sich bereits seit Jahrzehnten in Kultur, sodass mit diesen Zellen etablierte Xenograftmodelle ebenso wenig repräsentativ für die Komplexität und Heterogenität humaner Nierenzellkarzinome sind. Häufig verwendete Mausmodelle wie zum Beispiel subkutane Xenografts erscheinen aufgrund ihrer Einfachheit sowie Ein-schränkungen in Bezug auf Mikroumgebung, Metastasierungsverhalten und Tumorhe-terogenität mit der damit fehlenden Translationsmöglichkeit auf den Menschen für pati-entennahe Nierenzellkarzinomforschung ebenfalls wenig geeignet. Aus diesen Gründen sollte in dieser Arbeit durch Kombination zweier etablierter Techni-ken, zum einen Nierenzellkarzinom-Primärkulturen und zum anderen orthotope Nieren-zellkarzinom-Xenograftmodelle, ein personalisiertes präklinisches in-vivo Modell des Nierenzellkarzinoms etabliert werden. Ziel hierbei war es, zu untersuchen, ob ein lokal-invasives Wachstum von Tumoren auf diesem Weg möglich ist, welches Metastasie-rungsverhalten diese gegebenenfalls aufweisen und ob die angewachsenen Tumore histologisch und immunhistochemisch mit den Originaltumoren vom Patienten überein-stimmen. Hierzu wurden zunächst humane Nierenzellkarzinom-Primärkulturen renal subkapsulär in immundefiziente Mäuse implantiert. Im Verlauf wurden – soweit verfügbar - zusätzlich auch humane Tumorstücke unter die Nierenkapsel der Mäuse implantiert. Die Primär-zellkulturen und Tumorstücke stammten aus synchron, metachron oder nicht-metastasierten Nierenzellkarzinomen. Zudem wurde eine aus einer Nebennieren-Metastase generierte Primärzellkultur verwendet. Zur Kontrolle der Methodik wurden zusätzlich die schon in Vorarbeiten verwendeten CAKI-2-Zellen eingesetzt. Alle Primär-zellkulturen, die zur Implantation in Betracht kamen, wurden zunächst mittels Immunfluo-reszenz-Doppelfärbung mit CK, PAX8 und CD90 charakterisiert. Anschließend erfolgte ein 10- bis 55-wöchiges Follow-up mittels etablierter bildgebender Verfahren für Kleintie-re. Hierzu fanden die Kleintier-Sonographie, Kontrastmittel-verstärktes Mikro-CT und 9.4T MRT Verwendung. Die makroskopische Beurteilung der entstandenen Läsionen und Tumore erfolgte durch Abbau der Tiere und Explantation der operierten Nieren. Das Material wurde weiterhin histologisch untersucht. Neben der HE-Färbung wurden im-munhistochemische Färbungen der Präparate unter Verwendung von Antikörpern gegen Ki67, HUNU, Ku70, CAIX, CD90, PAX8, CK und Vimentin durchgeführt. Insgesamt wurden über einen Zeitraum von zwei Jahren 48 Mäuse operiert. Um einzu-schätzen, von welcher Relevanz das Ausmaß der Immundefizienz der Mäuse ist, wurden drei verschiedene Mausstämme (BALB/c Nude, CB17-SCID und NSG) verwendet. Es konnten 12 verschiedene Primärzellkulturen und vier Tumorstücke renal subkapsulär implantiert werden. Trotz Variation der Mausstämme und des implantierten Materials sowie methodischer Optimierung von Operationstechnik und bildgebenden Verfahren konnte lediglich ein Anwachsen der bereits etablierten Zelllinie CAKI-2 in drei Mäusen, sowie acht makroskopischer Läsionen und vier makroskopischer Tumore der Primärzell-kulturen nachgewiesen werden. Nach histologischer und immunhistochemischer Aufar-beitung der Tumore konnten die für das Nierenzellkarzinom typischen histologischen Charakteristika und Markerexpressionsmuster annähernd widergespiegelt werden. Eine Metastasierung konnte in keinem Fall nachgewiesen werden. Somit war die Etablierung eines individualisierten präklinischen in-vivo Modells nicht für jeden Patienten möglich. Das nur in wenigen Fällen erreichte lokal-invasive Tumor-wachstum bot bisher keine Möglichkeit zur Beurteilung des metastatischen Potenzials. Ein Vergleich histologischer und immunhistochemischer Kriterien in diesen Fällen konnte zwar vorgenommen werden, hat jedoch aufgrund des variablen Wachstums der ver-schiedenen Primärzellkulturen nur eine bedingte Aussagekraft. Dennoch konnte im Rahmen dieser Arbeit die Auswahl des Mausmodells und des Ausmaßes der Immunde-fizienz der Mäuse auf orthotope Xenograftmodelle mit zunächst möglichst immundefizi-enten Tieren wie NSG Mäusen eingegrenzt werden. Die Methodik, insbesondere die chirurgische Technik und die bildgebenden Verfahren, wurde optimiert. Zusätzlich konn-ten die Relevanz der genauen Charakterisierung der Primärzellkulturen, sowohl vor Im-plantation als auch nach Explantation der entstandenen Tumore, sowie einige mögliche Folgeversuche aufgezeigt werden. Vorerst sollte die Entwicklung weniger, aber gut charakterisierter, repräsentativer orthot-oper Xenograftmodelle im Vordergrund zukünftiger Bemühungen stehen. Diese kämen dann für die Beantwortung weiterer konkreter Fragestellungen in Betracht.

A large part of the findings from experimental research on renal cell carcinoma cannot be transferred to everyday clinical practice and patient care due to a lack of stable, rep-resentative in-vivo models. Time-consuming and expensive tumor grafts represent real-istic mouse models, though the extent of tumor growth is limited, as are the possibilities for standardization and parallel in-vitro experiments. Established cell lines generated from aggressive tumors such as CAKI-2, which were used here, have been in culture for decades. Xenograft models developed with these cells cannot unrestrictedly represent the complexity of clinically proven renal cell carcinoma. Frequently used mouse models like subcutaneous xenografts can neither be used due to their simplicity and their limita-tions regarding the tumor microenvironment, metastatic potential and tumor heterogene-ity. These limitations lead to a heavily impaired translation of experimental results to hu-man renal cell carcinoma. Therefore, the goal of this work was to develop a personalized preclinical in vivo model of renal cell carcinoma by combining two established techniques. The first technique is renal cell carcinoma primary cultures, the second one is orthotopic renal cell carcinoma xenograft models. The aim was to investigate if, by the combination of these two tech-niques, locally invasive tumor growth is possible, to what extent metastatic behavior of the human tumors can be reproduced and if histology and immunohistochemistry of the tumors grown in mice match those of the tumors that have grown in humans. First, renal cell carcinoma primary cultures were implanted into the renal subcapsular space of immunodeficient mice. Additionally, intact pieces of tumor tissue were used for renal subcapsular implantation in some cases. The primary cell cultures and tumor pieces came from synchronous metastasized, metachronous metastasized or non-met-astatic human tumors. Furthermore, a primary cell culture generated from an adrenal metastasis could be implanted. The CAKI-2 cells already used in the preliminary work were used as well as a control for the methodology. All primary cell cultures considered for implantation were first characterized by immunofluorescence double staining with CK, PAX8 and CD90. Afterwards, mice were examined in a 10 - 55-week follow-up using established imaging methods for small animals. Here, high-resolution 3D ultrasonogra-phy, contrast-enhanced micro-CT (μCT) and 9.4T MRI were used. Macroscopic evalua-tion of the resulting lesions and tumors were made by explanting the operated kidneys. These were further analyzed by histology and immunohistochemistry. In addition to he-matoxylin & eosin staining, the specimens were also stained by immunohistochemistry using antibodies against Ki67, HUNU, Ku70, CAIX, CD90, PAX8, CK and Vimentin. In a period of about two years, a total of 48 mice were operated. To evaluate the rele-vance of the extent immunodeficiency in mice, three different mouse strains (BALB/c nude, CB17 SCID and NSG) were used. 12 different primary cell cultures and four dif-ferent tumor pieces were implanted under the renal capsule of the mice. Despite of var-iation of mouse strains and implanted materials as well was optimization of the surgical technique and imaging methods, we only detected tumor growth of the already estab-lished cell line CAKI 2 in three mice and eight macroscopic lesions and four macroscopic tumors in the mice with primary cell lines. After histological and immunohistochemical processing, the histological characteristics and marker expression patterns typical of re-nal cell carcinoma could nearly be reflected in our xenografts. In no case metastatic potential could be found. Overall, it was not possible to establish an individualized preclinical in-vivo model for every patient. Invasive tumor growth in such few cases could not provide the possibility of evaluating the metastatic potential of this model. Histological and immunohistochem-ical staining of the grown tumors showed results matching well with the marker expres-sion pattern of human renal cell carcinomas, however, these results are limited by the low number of successfully engrafted primary cell lines. Nevertheless, within this work, the selection of the appropriate mouse model and the extent of the immune deficiency of mice could be limited to orthotopic xenograft models with strongly immunodeficient animals such as NSG mice. Despite the variation of mouse strains and implanted mate-rials, also optimization of the surgical techniques and imaging methods have been opti-mized. In addition, the importance of characterization of primary cell cultures before im-plantation and after explantation and possible follow-up experiments could be demon-strated. For the moment, the development of several well-characterized, representative orthot-opic xenograft models should be aimed at in future experiments. These could then be used for answering further specific questions.