The effects of brush cell-derived acetylcholine on the sensory innervation of the airways and lungs

Abstract

Zusammenfassung In der Luftröhre exprimieren epitheliale Chemorezeptorzellen, sogenannte Bürstenzellen (BC), viele Subtypen von Bittergeschmacksrezeptoren, begleitet vom transienten Rezeptor-Potential-Kationenkanal der Unterfamilie M5 (Trpm5). Frühere Arbeiten zeigten, dass der Bitterstoff Denatonium und bitter schmeckende bakterielle Stoffwechselprodukte wie Quorum-Sensing-Moleküle, die von gramnegativen Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa produziert werden, die Aktivierung der gustatorischen Geschmackssignale auslösen. Die Signalübertragung umfasst die Freisetzung von PLCβ2 und Inositoltriphosphat (IP3), gefolgt von einer Calcium-abhängigen TRPM5-vermittelten Signalübertragung, die Freisetzung Acetylcholin (ACh) umfasst. Dies wurde als signifikant für die Auslösung einer neurogenen Entzündung identifiziert, die durch die Freisetzung der neurogenen Peptide Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) und Substanz P (SP) gekennzeichnet ist und zu einer Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten führt. Außerdem führt die Freisetzung dieser Neuropeptide zur Plasmaextravasation und Diapedese. In dieser Studie untersuchten wir daher die Beteiligung cholinerger Rezeptoren auf den sensorischen Nervenfasern an der Induktion neurogener Entzündung in den Atemwegen. Darüber hinaus untersuchten wir das Vorhandensein des TRPM5-Kanals in den Neuronen der Spinalganglien (DRG) und des Jugulare-Nodosum-Komplexes (JNC) und testeten die Auswirkungen der TRPM5-Kanalfunktion auf die Sensitivität der TRPV1- und TRPA1-Kanäle in sensorischen Neuronen. Wir untersuchten auch die Rolle von ACh, das von BC stammt, auf die Trpa1+ und Trpv1+-Neuronen, die Atemwege innervieren. In dieser Studie wurden folgende Mausmodelle verwendet: Wildtyp (WT), Trpm5-defiziente, Trpm5-DTR (Mäuse, die den Diphtherie-Toxin-Rezeptor (DTR) in den Trpm5+ Zellen exprimieren, und in denen die Trpm5-exprimierenden Zellen nach Verabreichung von Diphtherie-Toxin (DT) deplitiert wurden), Trpm5-DREADD (Mäuse, die einen Designer-Rezeptor aktivierbar ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADD) in den Trpm5+ Zellen exprimieren, und in denen die Trpm5-exprimierenden Zellen nach Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO) aktiviert wurden) und Trpa1-DTR (Mäuse, die das DTR in den Trpa1+ Neuronen exprimieren, und in denen die Trpa1-exprimierenden Neuronen spezifisch durch DT-Gabe deplitiert wurden). Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation und die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten erhielten Mäuse Evans Blau und inhalierten Denatonium. Nach 30 min wurden die Luftröhren explantiert. Zusätzlich erhielten manche WT-Mäuse eine Lösung mit den cholinergen Rezeptorinhibitoren Mecamylamin (MEC) und Atropin injiziert. Für die Deplitionsversuche wurden die Mäuse an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit DT (20 ng/kg Körpergewicht, i.p.) injiziert. Der Verlust der Trpa1+ Nervenfasern wurde durch Immunhistochemie, [Ca2+]i -Imaging und real-time RT-PCR charakterisiert. Zusätzlich wurden Western Blot-Analyse, RT-PCR und Immunhistochemie angewendet, um das Vorhandensein des TRPM5-Kanals in den sensorischen Neuronen zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Neuronen des sensorischen Ganglions ( DRG und JNC) von WT-Mäusen und Trpm5-defizienten Mäusen isoliert, und die EC50-Antwort auf die Gabe vom Zimtaldehyd (CA, ein TRPA1-Agonist) und Capsaicin (ein TRPV1-Agonist) untersucht und vergleichen. Darüber hinaus erhielten Mäuse, die den DTR in den Trpm5+ BC im Trachealepithel exprimieren, eine Einzeldosis von 40 μl 200 ng DT intratracheal (IT). DRG und JNC wurden 48 Stunden später explantiert und vorsichtig für [Ca2+]i-Imaging dissoziiert. Ebenso wurden Mäuse, die den DREADD-Rezeptor in Trpm5+-Zellen exprimieren, dreißig Minuten nach der Inhalation von 100 μM CNO getötet, und anschließend wurden DRG und JNC für [Ca2+]i-Imaging explantiert und dissoziiert. [Ca2+]i-Imaging wurde eingesetzt , um die Sensitivität der sensorischen Neuronen in akuten und chronischen Infektionsmodellen zu untersuchen. Zusätzlich wurde der Effekt von Acetylcholin (ACh) auf die Aktivierung von Trpa1+ und Trpv1+ sensorischen Neuronen vom JNC untersucht, indem frisch isolierte Neuronen mit ACh behandelt wurden und die Veränderungen in der Sensitivität gegenüber TRPA1- und TRPV1-Agonisten gemessen wurden. Die Hemmung der cholinergen Rezeptoren führte im Vergleich zu der Gruppe, die mit dem mit Vehikel behandelt wurde, zu einer signifikanten Abnahme der Plasmaextravasation und der Neutrophilenrekrutierung. Immunohistochemie von DRG-Neuronen von DT-behandelten Trpa1tauGFP-DTR-Mäusen zeigte einen Verlust von Trpa1tauGFP+ Neuronen. Die Anzahl der Trpv1-exprimierenden Neuronen wurde um 80% reduziert. CGRP/SP-doppelimmunoreaktive Neuronen wurden nur vereinzelt gefunden. Unterstützend wurde das Volumen der CGRP+/SP+-Nervenfasern in trachealen Whole-mount-Präparaten von Mäusen, die in den die Trpa1+ Neuronen deplitiert wurden, reduziert. Eine geringe Anzahl von Primärneuronen, die aus DRG und JNC isoliert wurden, reagierte auf den TRPA1-Agonisten CA und den TRPV1-Agonisten Capsaicin. qRT-PCR zeigte, dass die Trpa1- und Trpv1-Expression in Neuronen in beiden sensorischen Ganglien signifikant herunterreguliert war. DT-behandelte Trpa1tauGFP-DTR wiesen nach BC-Stimulation keine EB-Extravasation und Neutrophilenrekrutierung auf. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass der TRPM5-Kanal in den sensorischen Neuronen, die die Lunge innervieren, vollständig abwesend ist. In Immunohistochemie mit DRG und JNC sowie im Western Blot mit Proteinlysaten von DRG und JNC aus Wildtyp-Mäusen fehlten ein TRPM5-Labeling. qRT-PCR mit cDNA, die aus DRG und JNC von Wildtyp- und Trpm5-defizienten Mäusen isoliert wurden, ergab keinen signifikanten Unterschied in der Trpa1- und Trpv1-Genexpression zwischen beiden Genotypen. Interessanterweise fanden wir bei einer Trpm5-Defizienz einer höheren Sensitivität von TRPV1 und TRPA1 gegenüber CA und Zimtaldehyd im Vergleich zur Antwort bei Wildtyp-Mäusen. Mehr noch führte die spezifische Depletion von BC unter Verwendung von DT im Trpm5-DTR-Mausmodell zu einer signifikanten Abnahme der EC50 für sowohl Capsaicin als auch CA im Vergleich zum Wildtyp. Dissoziierte Neuronen zeigten einen signifikanten Unterschied in ihrer Sensitivität, wenn BC selektiv im Trpm5-DREADD-Mausmodell aktiviert wurden. Die TRPA1-Reaktion auf 200 μM CA wurde gehemmt, während die TRPV1 eine signifikant höhere Empfindlichkeit gegenüber 50 nM Capsaicin zeigte. Dieses Ergebnis war ähnlich wie die beobachteten Reaktionen nach BC-Aktivierung durch Denatonium oder akute bakterielle Infektionen. Interessanterweise zeigten Mäuse mit chronischer Infektion 21 nur eine Abnahme der Empfindlichkeit von Trpa1 und nicht von Trpv1+ Neuronen. Bemerkenswerterweise führte die Exposition der sensorischen Neuronen gegenüber ACh zu einer Hemmung von TRPA1 und einer Aktivierung von TRPV1. Diese Effekte wurden mit den nikotinischen ACh-Rezeptorantaganisten MEC und Hexamethonium sowie mit dem generellen muskarinischen ACh-Rezeptorantaganisten Atropin gehemmt. Basierend auf all diesen Beobachtungen schlagen wir vor, dass die durch BC-induzierte protektive neurogene Entzündung von der cholinergen Übertragung von BC zu sensorischen Nervenfasern abhängt. Darüber hinaus mussen Die TRPA1- und TRPV1-Kanäle sowie ihre Interaktionen mit AChRs müssen als therapeutisches Ziel gegen neurogene Entzündungen und akute Lungeninfektionen wie beispielsweise Lungenentzündung weiter erforscht werden.

Summary In the trachea, epithelial chemoreceptor cells named brush cells (BC) express many bitter taste receptor subtypes accompanied by the transient receptor potential channel M5 (Trpm5). Previous work demonstrated that the bitter substance denatonium and bitter-tasting bacterial metabolites such as quorum-sensing molecules (QSM) produced by Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa, for example, triggered the activation of the gustatory taste signaling. The signaling involves phospholipase C β2 (PLCβ2) and the generation of inositol triphosphate (IP3) and subsequent TRPM5-dependent calcium-mediated signaling and the release of acetylcholine (ACh). This was found significant for provoking the generation of a neurogenic inflammation characterized by the release of the neurogenic peptides: calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP), and the subsequent neutrophils recruitment, plasma extravasation, and diapedesis. Therefore, in this study, we explored the involvement of cholinergic receptors (AChRs) on the sensory nerve fibers for the induction of neurogenic inflammation in the airways. Further, we investigated the occurrence of the TRPM5 channel in the dorsal root ganglia (DRG) and the jugular nodose complex (JNC) neurons, and tested the impact of TRPM5 on the Trpv1+ and Trpa1+ function in sensory neurons. We also looked at the role of ACh derived from BC on the Trpa1+ and Trpv1+ vagal nerve afferents innervating the airways. Here, wild-type (WT), Trpm5-deficient, Trpm5-DTR (mice that express diphtheria toxin receptor (DTR) in the Trpm5+ cells in which Trpm5-expressing cells were specifically ablated upon diphtheria toxin (DT) administration), Trpm5-DREADD (mice that express the DREADD receptor (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drug) in the Trpm5+ cells in which Trpm5-expressing cells were specifically activated upon clozapine N-oxide (CNO) administration), and Trpa1-DTR (mice that express the DTR in the Trpa1+ neurons in which Trpa1-expressing neurons were specifically ablated upon DT administration) mice models were used. WT mice were injected with inhibitors of AChRs mecamylamine (MEC) (nicotinic, 1mg/kg body weight, i.p.) and atropine (muscarinic, 1mg/kg body weight, i.p.). Next, these mice received Evans’s blue (EB, 20 mg/kg, i.v.). After inhalation of 1, 10, or 20 mM denatonium, tracheas were explanted, and EB and neutrophil extravasation were estimated. Additionally, Trpa1-DTR were injected with (DT) on three consecutive days. Trpa1+ nerve-fiber depletion was confirmed by immunohistochemistry and real-time RT-PCR. Next, mice with depleted Trpa1 sensory innervation received similar treatment to the mice with inhibited cholinergic signaling. In addition, Western blotting, RT-PCR, and immunohistochemistry were applied to investigate the occurrence of the TRPM5 channel in the sensory neurons. Moreover, neurons were isolated from WT mice and Trpm5-deficient mice to compare the EC50 response to the application of cinnamaldehyde (CA) and capsaicin, TRPA1 and TRPV1 agonists, respectively. Furthermore, Trpm5-DTR mice received a single dose of DT intratracheally (IT). DRG and JNC were explanted and dissociated for [Ca2+]i imaging. Likewise, Trpm5-DREADD mice were sacrificed after inhalation of CNO. Then, the DRG and JNC were explanted and dissociated for [Ca2+]i – imaging. The sensitivity of sensory neurons in an acute infection model: mice from WT and Trpm5-KO were infected via the negative gram bacterium Pseudomonas aeruginosa was investigated using [Ca2+]i –imaging. On the other hand, WT and Trpm5-KO mice chronically infected with the bacteria Rodentobacter heylii were assessed in the same manner. Additionally, the effect of ACh on the response of JNC Trpa1+ and Trpv1+ sensory neurons was studied by applying ACh to freshly isolated neurons, and measuring the changes in the sensitivity to TRPA1 and TRPV1 agonists. AChRs inhibition led to a significant decrease in plasma extravasation and neutrophil recruitment compared to the group treated with a vehicle. In DT-treated Trpa1-DTR mice, RT-PCR demonstrated that the Trpa1 and Trpv1 expression was significantly down-regulated in neurons in both sensory ganglia. On the other hand, immunohistochemistry on DRG sections from these mice had a significant increase in the numbers of Trpa1+ and Trpv1+ sensory neurons. Additionally, the same neuronal sections demonstrated a significant loss in the positive labeling of CGRP and SP compared to the vehicle. Furthermore, tracheal wholemount preparations showed a significant difference between the DT-treated Trpa1-DTR and vehicle in the volume of CGRP and SP. As a result, DT-treated Trpa1tauGFP-DTR mice lacked EB extravasation and neutrophil recruitment after BC-stimulation. Additionally, we have found that the TRPM5 channel is completely absent in the sensory neurons innervating the lung. Western blotting using protein lysates of DRG and JNC and Immunohistochemistry from WT mice lacked TRPM5-labeling. RT-PCR using cDNA isolated from DRG and the JNC of WT and Trpm5-deficient mice resulted in a non-significant difference between Trpa1 and Trpv1 gene expression among both genotypes. Moreover, Trpm5-deficiency correlated with a higher sensitivity of both TRPV1 and TRPA1 to capsaicin and CA compared to the response in WT mice. Interestingly, specific depletion of the BC using the DT on the Trpm5-DTR mouse model led to a significant decrease in the EC50 for both capsaicin and CA compared to the WT. Dissociated neurons showed a significant difference in their sensitivity when BC were activated using CNO in the Trpm5-DREADD mouse model. The TRPA1 response to 200 μM CA was inhibited, while the TRPV1 showed significantly higher sensitivity to 50 nM capsaicin. This result was similar to the observed responses after BC activation via denatonium or in acute bacterial infection. Interestingly, mice with chronic infection exhibited a decrease only in the sensitivity of Trpa1+ and not in the Trpv1+ neurons. Remarkably, exposing the sensory neurons to ACh resulted in an inhibition of TRPA1 and activation of TRPV1. These effects were inhibited with the ACh receptors-inhibitors MEC and atropine as well as the nicotinic antagonist hexamethonium. Based on all these observations, we propose that the BC-induced protective neurogenic inflammation is needed to eliminate inhaled substances via neutrophil recruitment and it depends on the cholinergic transmission from BC to the sensory nerve fibers. Moreover, the TRPA1 and TRPV1 channels and their communications with AChRs must be further explored as a novel and attractive therapeutic target against neurogenic inflammation and acute pulmonary infections such as pneumonia.