Gen- und Proteinexpressionsanalyse von 2D- und 3D-differenzierten alveolaren Epithelzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs)

Abstract

Lungenerkrankungen sind die weltweit zweithäufigste Todesursache. Zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten werden aussagekräftige Testsysteme benötigt. Human-relevante, physio- logische In-vitro-Modelle für die Lunge können beispielsweise aus humanen induzierten pluripo- tenten Stammzellen (hiPSCs) generiert werden. Die Herstellung alveolarer Epithelzellen aus hiPSCs für den Einsatz in der präklinischen Medikamentenentwicklung erfordert die Entwicklung und Optimierung robuster und reproduzierbarer Differenzierungsstrategien, da die Zellen in einer industriell relevanten und reproduzierbaren Quantität und Qualität zur Verfügung stehen müssen. Aus diesem Grund war die Zielsetzung dieser Arbeit, eine geeignete Strategie zur Differenzierung alveolarer Epithelzellen aus hiPSCs für ihren Einsatz in der präklinischen Forschung zu identifi- zieren. Zur Erreichung des Ziels wurden die planare, statische 2D- und die dynamische Bioreaktor-basierte 3D-Differenzierung als potentielle Methoden ausgewählt und verglichen. Da die alveolare Differenzierung ein komplexer Prozess aus fünf aufeinanderfolgenden Stufen darstellt, wurden Gen- und Proteinexpressionsanalysen relevanter Marker in jeder Differenzierungsstufe ver- gleichend zwischen 2D und 3D durchgeführt, um die Eignung der Kulturbedingungen für die Simulation der embryonalen Lungenentwicklung in vitro zu prüfen. Dabei wurde sowohl auf gesunde, als auch genetisch veränderte hiPSC-Linien zurückgegriffen und anhand dieser die Robustheit und Übertragbarkeit der Methoden auch für Krankheitsmodelle (am Beispiel Cystische Fibrose) demonstiert. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten, uniformen Differenzierungsprotokoll konnte gezeigt werden, dass sowohl die 2D-, als auch die 3D-Differenzierung geeignet ist, alveolare Epithelzellen aus hiPSC für die präklinische Forschung zu generieren. Es konnte zudem gezeigt werden, dass deutliche Unterschiede zwischen 2D und 3D in der Gen- und Protein- expression in den frühen Differenzierungsstufen auftreten, sich diese in fortschreitenden Entwicklungsstufen abschwächen und letztlich auf die Reife der resultierenden alveolaren Epithelzellen keinen Einfluss nehmen. Am aktuellen Krankheits- und Forschungsbeispiel COVID-19 konnte demonstriert werden, dass die aus beiden Differenzierungsstrategien stammenden alveolaren Epithelzellen für Infektionsstudien mit SARS-CoV-2 genutzt werden können. Zudem wurde in dieser Arbeit ein geeigneter Zeitpunkt zur Kryokonservierung von 2D-differenzierten Lungenvorläuferzellen identifiziert, um die zukünftige Aufbewahrung und Verkürzung der Differenzierung in alveolare Epithelzellen zu ermöglichen.

Lung diseases rank the second place of the global leading causes of mortality. In order to tackle pulmonary diseases and to find new therapeutic options, it is necessary to focus on the development of physiological relevant in vitro lung models. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived alveolar epithelial cells (AECs) are promising tools for pharmaceutical in vitro screening. With regard to the required quality and quantities for industrial application, the development of reproducible and robust differentiation processes is demanded. For this reason, the overall goal of this work was the identification of suitable strategies for the differentiation of AECs for their application in preclinical research. To achieve this goal, the planar, static 2D- and the dynamic bioreacor-based 3D-differentiation have been pursued and compared as potential methods. Since the alveolar differentiation is a complex process consisting of five consecutive stages, comparative gene and protein expression analysis between 2D and 3D have been performed in order to test the suitability of the methods to simulate the embryonal lung development in vitro. Healthy as well as genetically modified hiPSC-lines have been used to prove the robustness and transferability of the methods even for disease models as for Cystic Fibrosis. With the uniform differentiation protocol, which has been developed within the scope of this work, it could be demonstrated, that the 2D- as well as 3D-differentiation method are suitable to generate AECs for preclinical research applications. It could be shown, that significant differences in the gene and protein expression between 2D and 3D occur at early differentiation stages and mitigate at later developmental stages, thus not influencing the quality of the resulting AECs in the end. By the current example of COVID-19, AECs generated within both methods were successfully demonstrated to recapitulate the infection with SARS-CoV-2 at a physiological manner. Moreover, an appropriate time point for the cryopreservation of 2D-differentiated lung progenitor cells has been identified to enable the storage and shorter differentiation time of AECs for preclinical applications in future.